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研究背景:截止2016年,全球约有3670万人感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV),100 万人死于艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)及其相关性疾病。目前,由于抗HIV疫苗的研发尚未取得重大突破,因此安全有效的抗艾滋病药物的研发仍是艾滋病预防和治疗的主要手段。HIV进入抑制剂由于能够在病毒复制早期即发挥抗病毒活性,且对其他抗HIV药物耐药的病毒株仍然有效,因此其发展备受瞩目。HIV进入宿主细胞是由HIV的包膜蛋白和靶细胞膜受体所共同介导的。首先,HIV病毒的包膜糖蛋白gp120与宿主细胞膜上的CD4受体以及辅助受体CXCR4/CCR5结合;之后,HIV-1跨膜蛋白gp41发生构象改变,形成稳定的六螺旋结构(6-HelixBundle,6-HB),从而促进HIV病毒和宿主细胞膜融合,进而导致病毒入侵靶细胞。由于gp41是具有高度保守序列的病毒特有的包膜蛋白,因此其作为药物靶点更具优势。第一个HIV进入抑制剂恩夫韦地(T-20)即为衍生于gp41C-末端重复序列(C-heptadrepeat,CHR)的多肽类药物,其能与HIV的N-末端重复序列结合从而抑制六螺旋结构的形成。但T-20具有口服生物利用度低、半衰期短、生产成本高(90mg每天两次)等缺陷,急需发展有效、安全和价廉的新型靶向gp41的小分子化合物。目前,研究者们较多地关注于天然来源的阴离子化合物及其衍生物的抗HIV病毒活性研究。我们前期研究首次发现,来源于多穗柯叶子中的三叶苷具有较好的抗HIV活性,其属于二氢查耳酮的糖基化产物,因其安全有效,极有可能被开发成一类新型的抗HIV药物进行后续研发。研究目的:评价三叶苷抗HIV-1感染的活性及体外细胞毒性,深入探讨其抗HIV的作用、可能的作用机制及作用靶点,为研发新型、安全、有效的HIV-1进入抑制剂提供必要的理论依据。研究方法:1.选用不同的HIV-1实验室病毒株和克隆病毒株,检测三叶苷体外抗病毒活性。2.采用MTT方法,评估三叶苷对不同的靶细胞(TZM-b1,U87.CD4.CCR5,U87.CD4.CXCR4 和 MT-2 cells)和 HIV 效应细胞(CHO-WT cells)的细胞毒性。3.通过Time of addition实验、细胞-细胞融合实验、HIV-1单轮感染的假病毒实验、夹心ELISA酶联免疫实验、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳、圆二色谱法、基于细胞的ELISA实验和检测辅助受体CCR5/CXCR4的流式实验等,探讨三叶苷可能的作用机制。4.采用计算机模拟分析方法,检测三叶苷与gp41内部三聚体的卷曲螺旋表面的对接。5.通过定点突变实验,检测三叶苷抗HIV-1JR-FL突变病毒株的活性,分析三叶苷在gp41包膜蛋白上可能的作用靶点。6.通过SPR法,检测三叶苷与gp41的N36肽的亲和力。7.通过抗HIV感染实验,检测三叶苷与不同类别抗病毒药物的协同应用效果。研究结果:1.三叶苷对不同亚型的HIV-1实验室病毒株和克隆病毒株均具有较好的抗病毒活性。2.三叶苷对不同HIV作用靶细胞(TZM-b1,U87-CD4-CCR5,U87-CD4-CXCR4 和 MT-2cells),HIV 效应细胞(CHO-WTcells)和 PBMCs 均具有较低的细胞毒性。3.Time of addition、细胞-细胞融合及HIV-1假病毒实验均证实,三叶苷是通过抑制HIV-1包膜蛋白,从而阻止病毒膜融合过程,进而抑制HIV-1进入。4.夹心ELISA法、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳、圆二色谱法研究、基于细胞的ELISA实验和检测辅助受体CCR5/CXCR4的流式实验表明,三叶苷通过抑制HIV gp41六螺旋结构的形成,从而抑制HIV-1的进入。5.计算机对接分析显示,三叶苷能通过和Leu559、Ile564的疏水作用,和Leu559、Gln558的氢键作用,从而抑制HIV-1JR-FLgp41核心结构的形成。6.HIV-1定点突变实验结果表明,将HIV-1JR-FL gp41核心序列的Ile 564氨基酸突变为非保守的丙氨酸残基,三叶苷的抗病毒活性作用显著降低,提示Ile564可能是三叶苷作用的关键位点。7.SPR实验结果表明,三叶苷能与gp41N36多肽发生牢固结合,其结合的亲和力为1.73×10-7M。8.三叶苷与不同类别的抗病毒药物联用,能产生显著协同抗病毒效应。研究结论:三叶苷具有广谱的抗HIV-1活性,且具有较低的细胞毒性,其可能的作用机制是能特异地靶向gp41的N末端重复序列的区域,从而抑制HIV的进入。定点突变实验表明其作用靶点为gp41 口袋形成的残基(I564)位点。同时,三叶苷能与多种抗病毒药物产生协同抗病毒效应。因此,三叶苷有望被开发成为一类新型小分子HIV进入抑制剂,也能组成更多的“鸡尾酒”疗法处方,更有效地防治艾滋病及其相关疾病的发生发展,为临床应用提供一定的基础理论依据。