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帕金森病(Parkinsons disease,PD)是中老年人群中最常见的中枢神经系统变性疾病之一,具有隐性起病,缓慢进展的特征。随着我国人口老年化进程的加快,PD的发病率日益增高。我国目前大约有200万PD患者,每年新增PD病人约10万人。55岁以上人群的患病率为1.07%,75岁以上人群的患病率达到了2.5%,预计到2030年我国PD患者人数将近500万。PD的主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性、减少,其发生机制与氧化应激反应增强,线粒体功能障碍密切相关。当临床出现PD运动障碍症状时,黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的数目已经减少50%以上,纹状体DA含量的减少已达80%以上。由于目前尚无根本性的治疗方法,因此及早开展神经保护治疗,具有重要的临床意义。尿酸(uric acid,UA)是体内腺苷、鸟苷和饮食中细胞内核糖核酸嘌呤代谢的终末产物,两者分别占到体内尿酸总量的80%和20%,它是一种天然的抗氧化剂,清除人体中达60%的自由基。尿酸能清除O2-、OH和单态氧、阻止SOD的降解。SOD阻止NO与O2-反应生成过氧化亚硝酸盐。尿酸能有效阻止蛋白的硝基化,能螯合铁离子并且抑制铁依赖的抗坏血酸的氧化所导致的氧化损伤。另外,尿酸不仅仅是和氧自由基结合,而且还通过星形胶质细胞介导的机制来保护神经元。近年来的流行病学及临床研究发现PD发病及进展快慢与尿酸的关系密切相关。PC12细胞株源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,胞质富含多巴胺受体及合成、分解多巴胺所需的各种酶,生理及生化功能等方面接近于多巴胺神经元。6-OHDA是多巴胺类似物,其结构与多巴胺相类似,常被误作为DA神经递质摄入DA能神经元,选择性地破坏DA能神经元,造成DA能神经元死亡,在PD病人脑内和尿样中检测到6-OHDA。6-OHDA作为多巴胺神经元的选择性毒素,常被应用于制作帕金森动物和细胞模型。本实验就尿酸是否对6-OHDA造成的PC12细胞损害具有保护作用进行研究。第一部分尿酸和6-OHDA对PC12细胞活性的影响目的:评价尿酸(uric acid UA)和6-OHDA对PC12细胞活性的影响。方法:PC12细胞用含10%小牛血清的DMEM进行常规培养,2～3天换液。待细胞增长至80%融合时,用0.25%胰酶消化细胞,加含血清的培养基终止消化,吹打成为单细胞悬液,1:4比例传代分瓶。采用MTT分别法检测不同剂量的UA、6-OHDA对细胞活性的影响。分组:6-OHDA分为对照组(DMEM)、25、50、75、100、125μmol/L作用24小时对细胞活性的影响。尿酸组分为:对照组(DMEM)、100、200、300、400、500μmol/L尿酸组。结果:6-OHDA能降低PC12细胞的生存率,25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100、125μmol/L6-OHDA作用24小时细胞生存率分别为93.3±6.0%、79.86±5.20%、55.92±3.72%、47.05±2.06%、46.56±3.43%;100~500μmol/L尿酸作用PC12细胞24小时, PC12细胞生存率分别为93.3±6.0%、98.9±6.8%、105.0±4.0%、106.6±5.0%,131.5±16.4%,其中100~400μmol/L的尿酸和对照组100±3.7%相比较,无显著性差异(P>0.05),对PC12细胞生存率没有明显影响,而500μmol/L尿酸组PC12细胞生存率与对照组相比较显著提高(P<0.01)。结论:6-OHDA对PC12细胞具有毒性作用,浓度越高,毒性作用越强;一定浓度范围的尿酸对PC12细胞的生长没有影响。第二部分尿酸减轻6-羟基多巴胺对PC12细胞的毒性作用目的:评价尿酸减轻6-OHDA对PC12细胞的毒性作用。方法:PC12细胞用含10%小牛血清的DMEM进行常规培养, 2～3天换液。待细胞增长至80%融合时,用0.25%胰酶消化细胞,加含血清的培养基终止消化,吹打成为单细胞悬液,1:4比例传代分瓶。采用MTT法检测50μmol/L 6-OHDA作用6h、12h、24h对细胞的毒性作用,相同条件下同时检测尿酸的细胞保护作用。MTT法检测,分组为:对照组(DMEM培养基)、6-OHDA(50μmol/L)组和尿酸(100μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)、尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)、尿酸(300μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)、尿酸(400μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)。Caspase-3免疫荧光染色法检测PC12细胞caspase-3活性,选取其中一个保护作用明显,单独对PC12细胞生存率没有影响的尿酸浓度(200μmol/L),观察药物作用24小时其对6-OHDA造成的caspase-3活性影响,分为正常对照组(DMEM培养基)、6-OHDA(50μmol/L)组,尿酸(200μmol/L)组和尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)组。Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,分组同caspase-3免疫荧光染色。结果:50μmol/L 6-OHDA作用6、12、24h, PC12细胞生存率进行性下降:95.5±2.4%, 88.7±5.1%,73.8±10.0%。其中12、24h细胞生存率显著下降(P<0.01);尿酸(100～400μmol/L)对50μmol/L 6-OHDA作用6、12、24h造成的PC12细胞生存率下降有显著的提高(P<0.01)。Caspase-3免疫荧光染色检测PC12细胞内caspase-3的活性结果显示对照组和200μmol/L尿酸组可见弱的红色荧光,50μmol .L6-OHDA组可见强烈的红色荧光,尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)较50μmol/L 6-OHDA组红色荧光减弱。Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率尿酸单独作用于PC12细胞24小时的凋亡率3.2±0.8%和对照组3.5±1.3%没有差别(P>0.05),加入50μmol/L 6-OHDA作用24小时后,细胞的凋亡率9.8±2.3%和对照组相比显著增高(P<0.05),而尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)组的细胞凋亡率(6.0±1.5%)和6-OHDA(9.8±2.3%)组比较,凋亡率显著降低(P<0.05)结论:尿酸能够明显减轻6-OHDA对PC12细胞的损伤,减少6-OHDA所致的caspase-3的激活,减少6-OHDA导致的凋亡。结论1.一定剂量的6-OHDA对PC12细胞具有毒性作用。2.一定范围剂量的尿酸对PC12细胞生长没有影响。3.适当剂量的尿酸能够显著减轻6-OHDA对PC12细胞的损伤,减少6-OHDA所致的caspase-3的激活,减少6-OHDA导致的凋亡。