甜瓜黄绿叶色基因CmGLK的克隆及功能验证

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叶色突变体是研究叶绿体发育和光合作用的理想材料,叶绿体发育相关基因的突变会引起叶绿体发育缺陷并导致植物叶色突变和光合作用降低,同时叶绿体的发育对果实品质也有很大的影响。课题组前期已经对一个控制甜瓜黄绿叶色性状的基因进行了精细定位,在此研究基础上,本研究通过对亲本的重测序分析,成功筛选并克隆到甜瓜叶色黄绿性状候选基因CmGLK,并对其序列进行生物信息学分析,同时构建过表达载体转化拟南芥glklglk2突变体进行功能互补验证。本研究的结果不仅能丰富和完善GLK转录因子调节叶绿体形成的分子机制,也将为甜瓜果实品质改良提供新的思路和方向。主要研究结果如下:(1)通过对甜瓜亲本DHL92、M68进行重测序,发现在候选区段内只有一个候选基因,该基因编码一个MYB类转录因子,序列分析表明该基因含六个外显子,其中第三个外显子处有一个碱基C的缺失,导致该基因发生移码突变,最终出现黄化突变体,成功在候选区段定位到候选基因。进一步利用突变位点开发一个dCAPS标记,对F2群体和自然群体进行基因型分析,发现dCAPS与叶色表型表现共分离,表明该基因就是控制甜瓜叶色黄绿性状的候选基因CmGLK(Gene ID:XP008455954),该基因的ORF为1353 bp,编码450个氨基酸。(2)通过构建CmGLK、cmglk、AtGLK1的过表达载体并分别转化拟南芥glklglk2黄化突变体,对各自转基因植株进行表型观察,发现CmGLK和AtGLK1基因能够恢复拟南芥glklglk2黄化突变体的叶色表型,实现功能互补,而cmglk则不能恢复拟南芥glklglk2黄化突变体的表型。此外,通过构建CmGLK、cmglk、AtGLK1的GFP融合表达载体并瞬时转化拟南芥原生质体,确定CmGLK、cmglk、AtGLK1皆位于细胞核。(3)通过对35S:CmGLK的纯系植株的光合速率的测定,发现CmGLK超表达之后,提高了转基因株系的光合速率。此外,通过对35S:CmGLK、35S:AtGLK1纯系植株的叶绿素荧光动力参数的测定,GLK超表达之后,F0、Fm、qN-lss、qP-lss有不同程度的提升,相对于突变体atglklglk2,显著提高了拟南芥消耗过剩光能的能力和光反应中心Ⅱ(PSⅡ)的开放比例。(4)在模拟干旱和盐胁迫条件下对拟南芥野生型Col-0、拟南芥glklglk2突变体及超表达株系的种子萌发率进行统计分析,发现突变体的萌发率比野生型低,超表达株系的萌发率要比突变体高。表明CmGLK基因在拟南芥种子萌发的过程中起正调控作用。(5)通过对各类植物中的GLK同源基因的聚类分析,发现GLK基因在低等到高等植物中都有分布:GLK基因最早出现在绿藻中,在苔藓植物门、石松门、单子叶植物、双子叶植物中都有分布;该基因在大部分植物中都是成对存在的,但在二倍体瓜类作物中都是以单拷贝的形式存在。
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