先天性心脏病是新生儿出生缺陷中发病率和死亡率最高的疾病,研究表明心脏发育调控基因的表达异常是导致先心病的内在原因。阐明心脏在早期发育过程中的基因调控机制就成为治疗先心病的关键。随着斑马鱼成为研究发育生物学和功能基因组学的脊椎动物模型,利用该模型可为探究心脏的早期发育和先心病发生的分子调控机制提供行之有效的研究策略。本文主要利用斑马鱼模型研究了tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心脏早期发育过程中的调控功能。一、tmp3基因在心脏发育中的功能研究tmp3基因为实验室早期克隆的一个心脏发育候选基因,本文利用Tol2转座系统构建的tmp3启动子驱动的EGFP表达转基因斑马鱼品系Tg(tmp3:EGFP),简称tmp3EGFP。追踪该转基因斑马鱼中EGFP的表达发现,在受精后36,48和56小时(hpf)Tmp3蛋白主要强表达于心脏和骨骼肌中。原位杂交技术检测EGFP早期表达信号发现在40%外包时,表达信号定位于卵裂球边缘生心区;22体节时,信号定位于心锥和骨骼肌;24 hpf,信号定位于心管和骨骼肌;48 hpf,信号定位在骨骼肌和跳动的心脏中。将Tg(tmp3:EGFP)鱼与标记心内膜层细胞的Tg(fli1a:DSRED)鱼及标记心肌层细胞的Tg(myl7:DSRED)鱼分别杂交,对发育到72 hpf的双转基因斑马鱼进行激光共聚焦显微镜单层切面扫描,结果显示心脏中的tmp3基因表达只定位于心肌层。利用TALEN打靶技术构建的tmp3基因敲除斑马鱼品系进行Western blot检测证明,tmp3敲除阳性个体中没有相应的功能型蛋白合成。观察tmp3敲除纯合子的表型发现,tmp3敲除斑马鱼表现为心包肿大,心脏腔室减小,环化异常和躯干发育异常。观察Tg(myl7:DSRED;flk1:EGFP)双转基因tmp3敲除斑马鱼的表型发现,tmp3基因敲除导致斑马鱼心脏腔室减小和房室通道缩窄。为了探究心脏腔室的减小是由于心肌细胞大小的减小还是由于数目的减少导致的,利用细胞膜紧密连接蛋白ZO-1的抗体标记细胞膜,检测tmp3敲除斑马鱼心脏细胞的大小,结果表明tmp3敲除鱼心脏中的细胞大小并未发生显著变化。另外,通过肌球蛋白重链MHC抗体和核内DNA染料DAPI对心肌细胞染色并计数发现,48hpf tmp3敲除鱼心脏中心肌细胞的数量显著减少。证明tmp3基因敲除斑马鱼心脏腔室的变小是由于心肌细胞数量减少导致。Edu细胞增殖分析结果显示tmp3基因敲除后增殖的幼鱼心肌细胞数量显著减少。而TUNEL凋亡细胞分析结果显示tmp3敲除幼鱼心脏细胞的凋亡并未发生显著变化。由此证明tmp3基因通过影响心肌细胞的增殖从而调控斑马鱼早期心脏发育。本实验室早期通过酵母双杂交和COIP相互作用分析筛选出与Tmp3蛋白相互作用的蛋白分子Creb2,那么Tmp3蛋白是否通过与Creb2相互作用从而调控心脏发育呢?本文利用免疫荧光和激光共聚焦扫描检测斑马鱼胚胎心脏内源Tmp3与Creb2蛋白的表达发现,这两个蛋白在72 hpf的幼鱼心脏中存在共定位。进一步的免疫荧光实验证明在H9c2大鼠心肌细胞中TMP3蛋白与CREB2蛋白共定位于心肌细胞的细胞核中。接下来,用免疫荧光检测了诱导向心肌细胞分化的P19小鼠畸胎瘤干细胞在诱导第6天和第10天内源Tmp3和Creb2蛋白的定位。发现在诱导第6天两种蛋白大部分共定位在细胞质中,而在诱导第10天这两种蛋白共定位在细胞核中。提示随着胚胎细胞向心肌细胞分化,Tmp3与Creb2两种蛋白逐渐从细胞质迁移到细胞核中,提示这两个蛋白的入核进程可能与心肌细胞的发育过程相关。由于Tmp3是一个不具备入核信号的跨膜蛋白,为探究Tmp3是否依赖与Creb2的相互作用入核,构建tmp3全长荧光质粒发现该质粒在细胞核与细胞质中均有表达,而除去与Creb2相互作用结构域(134-240AA)后的截短体蛋白Tmp3荧光质粒仅定位在细胞质中。由此证明,Tmp3蛋白是通过与Creb2蛋白相互作用介导入核的。早期心肌细胞增殖和分化的关键调控因子gata4敲减的斑马鱼胚胎与tmp3基因敲除斑马鱼表现出类似的心脏缺陷表型,提示gata4可能是Tmp3-Creb2复合物的下游调控靶标。本文利用RT-qPCR检测了tmp3敲除斑马鱼胚胎中gata4及其调控心肌细胞增殖的下游因子ccnd2a和cdk4的表达。结果表明,gata4,ccnd2a和cdk4在tmp3敲除斑马鱼中均显著下调。由此提示gata4可能是Tmp3-Creb2复合物的下游靶标。另外在tmp3基因敲除斑马鱼一细胞期显微注射gata4mRNA可以一定程度上拯救心脏的发育畸形,从而进一步证明gata4为Tmp3-Creb2复合物调控早期心脏发育的下游靶标。利用RT-qPCR技术检测法洛式四联症(TOF)病人心肌组织中TMP3 mRNA的表达量发现TOF病人心肌组织中TMP3 mR NA的水平显著下调。随后通过测序分析在TOF病人中检测到一个TMP3基因的错义突变(c.820C>T,p.R274C)。将突变的TMP3质粒(R274C,TMP3m)转染到H9c2细胞中,利用荧光报告系统分析发现GATA4基因的上游应答原件CRE-luc荧光报告基因的转录活性较野生型对照组显著降低。而且western blot检测发现TMP3m转染的H9c2细胞中GATA4蛋白的表达量也显著降低。由此可见,TMP3m突变可能通过影响GATA4蛋白的表达从而参与TOF的发病机制。二、hprg1b基因在心脏发育中的功能研究hprg1b基因是实验室前期通过果蝇P因子突变筛选出的另一个早期心脏发育候选基因。本文为了追踪hprg1b基因在心脏早期发育过程中的时空定位,利用Tol2转座系统构建了hprg1b启动子驱动EGFP蛋白表达的转基因斑马鱼品系Tg(hprg1b:EGFP),简称1bEGFP。追踪胚胎发育过程中绿色荧光信号的表达发现在16hpf hprg1b基因的表达信号定位于侧板中胚层两侧的心脏原基中,随后在20hpf融合信号出现在心锥区域,在24hpf定位于心管的位置,48hpf后信号在心脏中检测到。由此可见,hprg1b基因的时空表达谱与早期心脏的形态建成区域一致。本文将1bE GFP转基因斑马鱼分别与Tg(myl7:DSRED)和Tg(kdrl:MCHERRY)转基因斑马鱼杂交后得到Tg(1bEGFP;myl7DSRED)和Tg(1bEGFP;kdrlMCHERRY)双转基因斑马鱼,观察72 hpf的转基因斑马鱼心脏发现Hprg1b蛋白表达只定位于心肌层。进一步检测75hpf的Tg(1bEGFP;myl7DSRED)双转基因斑马鱼心脏发现hprg1b强表达于流出道,房室通道和流入道处。此时心脏的3D立体图像显示hprg1b只在一部分心肌细胞细胞中表达。流氏细胞仪分析2个月大的Tg(1bEGFP;myl7DSRED)转基因斑马鱼原代心脏细胞发现,hprg1b阳性细胞只占心脏细胞的10.7%,从而提示hprg1b阳性细胞可能是一种特殊的心肌细胞。本文构建了hprg1b过表达质粒pC V/hf,将该质粒转染进入斑马鱼干细胞系Z428中。RT-PCR初步检测发现hprg1b过表达质粒转染1天后Z428细胞中早期心肌细胞标记基因gata4和nkx2.5,心内膜早期标记基因etv2和心肌细胞分化标记基因myh6的表达均出现明显的上调。进一步用ddPCR技术精确定量这四个基因在hprg1b过表达的Z428细胞中的表达变化,发现在hprg1b过表达1天后四个基因的表达与对照组相比均显著上调;2天后,nkx2.5,gata4和myh6的表达均持续增加,但etv2的表达开始下调;第三天,3个心肌细胞标记基因的表达持续上调,但心内膜标记基因etv2却持续下调。由此推断,hprg1b是通过持续诱导心肌细胞早期标记基因的表达,从而调控胚胎干细胞向心肌细胞分化进而调控心脏发育的。三、cxxc5基因在心脏发育中的功能研究CXXC5(CXXC-type zinc-finger protein 5)被报道在其表达的组织中发挥广泛的生理和病理学功能。以往的研究表明CXXC5在心脏中高表达,并且CXXC5与病理性和生理性心肌重构相关,提示CXXC5很可能在心脏发育、心肌分化和心脏疾病的发病机理中发挥重要作用。尽管如此,至今仍缺乏一个直接的证据阐明CXXC5在心脏中的功能。生物信息学分析表明CXXC5的功能结构域在进化上高度保守,因此利用斑马鱼模型探究CXXC5在早期胚胎心脏发育中的功能可为人类早期心脏发育关键调控因子的筛选提供线索。本文利用RT-PCR检测cxxc5基因在斑马鱼早期胚胎中的表达,发现cxxc5在40%外包时起始表达,并持续表达于胚胎与成体斑马鱼中。原位杂交检测cxxc5 mR NA的时空表达模式表明cxxc5在40%外包时表达于卵裂球两侧边缘生心区,在22体节时cxxc5表达于心锥,在24hpf表达于心管,在48hpf表达于心脏。cxxc5的时空表达模式提示cxxc5可能参与调控早期心脏发育。Morpholino敲减cxxc5的表达对心脏发育产生了显著的影响。注射了cxxc5 MO的胚胎约70%表现出环化异常,发育不良和心包水肿的表型。胚胎注射Morpholino后的致死率统计发现,大部分的cxxc5敲减胚胎在第七天死亡。cxxc5MO与cxxc5加帽mR NA共注射可以在一定程度上拯救cxxc5 MO敲减的胚胎表型,说明cxxc5敲减胚胎的表型是由于cxxc5 mRNA表达降低造成的。原位杂交检测心肌标记基因cmlc2的表达,发现24hpf的cxxc5敲减胚胎中cmlc2的表达停留在中线,而并未像野生型一样前端迁移到左眼处。48hpf的cxxc5敲减斑马鱼的心室和心房纵轴间的平均夹角为12°,与野生型的胚胎的平均夹角27°相比显著减小。本文进一步利用Semi-Automated Optical Heartbeat Analysis探究了cxxc5敲减对胚胎心脏的生理学功能的影响。分析表明,cxxc5敲减后,胚胎的心动周期显著延长,心率显著减缓,心脏收缩面积改变率显著减小。由此证明,cxxc5敲减后斑马鱼的心脏功能受损。前期研究表明人类CXXC5与SMADs蛋白(SMAD2,SMAD3)存在相互作用,本文通过生物信息学分析发现人类的CXXC5,SMAD2和SMAD3与斑马鱼中的同源蛋白高度同源。本实验室曾利用COIP和GST-pulldown证明了斑马鱼Cxxc5和Smad2,Smad3的相互作用。于是本文分别检测了TGF-β信号荧光报告质粒CAGA-LUC,BMP信号荧光报告质粒BRE-LUC,和Activin信号荧光报告质粒3TP-LUC在过表达Cxxc5的H9c2细胞中转录活性,结果表明CAGA-LUC和BRE-LUC的荧光活性显著增强,而3TP-LUC的活性没有变化,由此提示cxxc5基因在心肌细胞中影响了TGF-β信号和相关的BMP信号。为了找寻到TGF-β信号中Cxxc5-Smads复合物的靶点,本文分析了几个经典TGF-β信号下游靶基因nkx2.5,gata4,hand2,和has2启动子区域中是否包含MH1结合结构域SBE(Smad-binding element,CAGAC)和CpG岛。结果表明gata4,hand2和has2的启动子中均包含Smad-binding element(CAGAC)位点和CpG岛。RT-PCR分析表明cxxc5敲低的斑马鱼中hand2和has2的表达显著下调。而且胚胎注射hand2加帽mRNA可有效的拯救cxxc5 MO导致的心脏环化缺陷。从而证明cxxc5可能通过TGF-β信号的hand2调控心脏的环化过程。文献报道人类CXXC5基因在先心病患儿术前和术后的表达具有显著差异,本文利用RT-qPCR检测了TOF病人中CXXC5的表达,发现TOF病人中CXXC5 mRNA水平显著下调,提示CXXC5可能是TOF的临床诊断候选靶标分子。上述结果表明,斑马鱼cxxc5是在早期心脏发育中表达的内源性因子,可能在心脏左右不对称的形态建成中发挥重要作用,并且首次在体内证明cxxc5可以通过TGF-β信号调控心脏发育与心脏环化。