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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是一种恶性程度高、预后凶险的肿瘤,总体5年生存率只有7%左右。在全世界范围内肝癌约占全部人类恶性肿瘤的5.6%,其中一半以上发生在我国,并且发病率近年来还呈上升的趋势。虽然全世界对肝癌的研究已有多年的历史并已取得长足的进步,但它的发病机制至今仍未得到充分阐释。现已知肝癌的形成是一个多因素、多步骤、多基因参与的过程,仅用传统的单因素、单基因相关性分析无法准确反映肝癌复杂的病理机制。近年来迅速发展的蛋白质组学技术为动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化提供了一个高效的研究平台,推动了肝癌发生机制、新的肝癌诊断标志物和治疗靶标等方面的研究进展。本研究用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱发大鼠肝癌形成,以γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)染色阳性的肝细胞增生灶(γ-GT阳性灶)为标志获取肝癌前病变的组织标本,再用比较蛋白质组学技术对大鼠肝癌组织、肝癌前病变组织和正常肝组织的全蛋白质组表达谱进行差异分析,筛选出一批差异表达蛋白。随后,本研究对部分筛选出来的差异表达蛋白质如醛糖还原酶1B10(aldo-keto reductase family 1 member B10,AKR1B10)、波形蛋白(VIMENTIN)进行表达水平改变的验证,再应用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术对AKR1B10进行肿瘤相关生物学功能分析和机制探讨,以及应用组织芯片和免疫组化技术观察和分析AKR1B10在较大样本量的人肝癌组织中的表达及其临床意义。研究结果表明,AKR1B10在肝癌的发生发展过程中可能通过调节肿瘤相关基因的表达来影响细胞的增殖和凋亡能力,它在肝癌组织中的表达与肝癌组织的分化程度相关,在血清甲胎蛋白(α-fetal protein, AFP)阴性患者的肝癌组织中高表达。这些结果提示AKR1B10对预测肝癌的发生和预后可能有一定的价值,是一种具有潜在应用前景的肝癌早期诊断的分子标志物。研究分以下四部分进行。第一部分DEN诱发大鼠肝癌发生过程中差异表达蛋白质组学研究建立DEN诱发大鼠肝癌实验模型,应用比较蛋白质组学技术观察大鼠肝癌发生发展不同阶段的肝组织中蛋白质表达谱的改变,从中筛选出在肝癌发生过程中起重要作用的候选蛋白。6周龄的雄性近交系Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,实验组动物经腹腔注射DEN诱发肝癌,对照组不予DEN处理。实验过程定期处死两组部分动物,通过γ-GT组织化学染色并结合HE染色识别和获取肝癌前病变组织、肝癌组织和正常对照肝组织。三种组织标本各取6例,分别提取肝组织总蛋白,然后按组织类别将6份总蛋白等量混合,获得癌前、肝癌和正常三种组织总蛋白。经双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)进行总蛋白分离,通过ImageMaster软件分析找出差异表达蛋白点,应用基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)进行肽指纹谱鉴定。质谱鉴定数据送入NCBI非冗余数据库,通过MASCOT搜索引擎检索,得到差异表达蛋白质。最后通过Gene Ontology、SWISSPROT和NCBI等数据库分析差异表达蛋白质的细胞内定位、分子功能和生物过程,并应用IntACT数据库对差异表达蛋白质进行相互作用网络分析。动物实验于30周结束,结果显示实验组共有9只动物发生肝癌,肝癌发生的最早时间为实验第21周;对照组无1例发生肝癌。γ-GT组织化学染色显示随着DEN诱癌时间延长,γ-GT阳性灶数量增多、面积增大,癌前组织中γ-GT阳性灶总面积与肝组织切片面积比达29%~43%;肝癌组织γ-GT染色全为阳性;正常肝组织内无γ-GT阳性灶。应用2-DE技术筛选出组间表达水平差异≥2倍或特异存在的蛋白点127个,质谱鉴定出AKR1B10、VIMENTIN和粘连蛋白受体1(laminin receptor 1,LAMR1)等82种蛋白质,其中肝癌组织与正常组织相比有75个差异表达蛋白质,肝癌组织与癌前组织相比有39个差异表达蛋白质,癌前组织与正常组织相比有14个差异表达蛋白质,在以上三种比较中同时差异表达的蛋白质有5个。生物信息学分析显示,这些差异表达蛋白质主要位于细胞质和线粒体;发挥酶的活性作用、氧化还原和结合等功能;参与的主要生物学过程为代谢、运输和转移、生物合成和氧化应激等。应用IntACT数据库分析差异表达蛋白质的相互作用,发现4型葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter type 4,GLUT4)是相互作用网络中的一个共同节点。以上结果表明通过γ-GT组织化学染色和HE染色相结合的方法有助于识别和获取大鼠肝癌前病变组织、肝癌组织及正常肝组织;大鼠肝癌发生发展不同阶段的蛋白质表达谱存在明显差别;肝癌的发生发展可能与多种蛋白质表达水平的改变有关。第二部分差异表达蛋白AKR1B10和VIMENITN在大鼠和人肝癌组织中的表达验证由于从2-DE到质谱鉴定技术流程长、影响因素多,为了保证以上筛选实验结果的可靠性以便对相关分子作进一步研究,本部分研究对筛选出来的部分蛋白质进行差异表达的验证。研究方法主要为应用Western blot和RT-PCR方法分别检测AKR1B10和VIMENTIN在大鼠和人肝癌组织中的蛋白质水平和mRNA水平的表达情况,以及应用免疫组化染色观察AKR1B10在肝细胞中的定位。结果显示:①AKR1B10蛋白定位于肝细胞胞浆内,其蛋白表达水平和mRNA表达水平在大鼠正常肝、肝癌前病变、肝癌组织中依次上调;AKR1B10蛋白表达水平在人正常肝、癌旁肝及肝癌组织中也依次上调。②VIMENTIN蛋白在大鼠正常肝、肝癌前病变、肝癌组织中表达依次明显上调;VIMENTIN mRNA在大鼠肝癌组织中明显升高,在肝癌前病变组织中轻度升高但与正常肝组织间的差别无统计学意义;VIMENTIN蛋白在人正常肝、癌旁肝及肝癌组织中的表达依次上调。以上结果显示的AKR1B10和VIMENTIN的表达变化趋势与2-DE结果基本一致,提示本研究采用的2-DE和MALDI-TOF-MS/MS蛋白质组学技术平台具有相当的稳定性和可靠性。在mRNA和蛋白质两个水平上,AKR1B10和VIMENTIN不仅在大鼠正常肝、肝癌前病变、肝癌组织中表达依次上调,并且在人正常肝、肝癌旁组织、肝癌组织中的表达水平也显著依次升高,提示这两个蛋白可能参与人类肝癌的发生发展过程。第三部分AKR1B10在肝癌发生过程中作用及机制的初步探讨为了进一步探讨AKR1B10在肝癌发生发展中的作用,本部分应用RNAi技术和肿瘤相关生物学功能鉴定方法,观察AKR1B10表达被抑制后对人肝癌细胞系MHCC97H相关功能的影响,并探讨其机制。首先应用RT-PCR、Western blot检测AKR1B10 mRNA和蛋白在肝癌细胞系MHCC97L、MHCC97H、SMMC-7721和BEL-7402及正常肝细胞系Changliver中的表达以筛选AKR1B10表达量最高的细胞系,然后采用RNAi技术,将化学合成的两对针对AKR1B10的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)瞬时转染至肝癌细胞MHCC97H细胞,再通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)、细胞免疫荧光、Western blot及AKR1B10酶活性检测,筛选干扰效果最明显的一对siRNA作RNAi组,另设置阴性对照组(Mock,转染无效用的dsRNA)和空白对照组(Con,不作任何转染),最后观察AKR1B10表达下调后对MHCC97H细胞的增殖、凋亡、粘附、运动等肿瘤相关生物学功能的影响,并用Real-time PCR检测干扰AKR1B10表达后c-myc等肿瘤相关基因的表达变化。结果显示,AKR1B10在所检测的四种肝癌细胞系中均有不同程度的表达,以在MHCC97H细胞中表达最强;在正常肝细胞Changliver中无表达。瞬时转染AKR1B10-siRNA 48h和72h后,MHCC97H细胞中的AKR1B10 mRNA和蛋白表达受到较为明显的抑制。CCK-8实验结果显示AKR1B10表达被干扰后MHCC97H细胞生长受到抑制,抑制率在24h、48h、72h和96h分别为6.5%、18.0%、26.6%和22.7%。流式细胞仪检测结果显示RNAi组的凋亡细胞比例显著高于与阴性和空白对照组,三组分别为37.30%、5.18%和5.57%(p<0.05)。粘附实验结果显示RNAi组在30min、50min和70min时的粘附细胞数与阴性对照组和空白组均无明显差异。体外运动实验结果显示RNAi组、阴性对照组和空白对照组中MHCC97H细胞穿过微孔滤膜到达下室面的细胞数分别为18±2、20±3和21±4个,三组间的差别无统计学显著性。Real-time PCR检测发现干扰AKR1B10表达后,RNAi组中癌基因c-myc、c-fos、N-ras和增殖相关基因ki-67表达下降,促凋亡基因casps-3和bax表达上调。以上提示AKR1B10可能通过调节肿瘤相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,从而引起肝细胞的恶性转化。AKR1B10与肝癌细胞的粘附和运动能力无明显关系。第四部分AKR1B10在较大样本人肝癌组织中的表达及临床意义的研究本部分利用组织芯片和免疫组化技术检测AKR1B10蛋白在65例人肝癌及其相应癌旁组织、14例正常人肝组织中的表达情况,分析肝癌组织中AKR1B10蛋白表达与患者的临床病理特征的关系,评估AKR1B10作为新的肝癌早期诊断分子标志物的可能性。结果显示AKR1B10蛋白在人正常肝组织、癌旁肝组织及肝癌组织中的表达率和表达量均依次升高,并且差别具有统计学显著性(p<0.05)。AKR1B10在肝癌组织的表达水平与该组织的Edmondson病理分级相关,即其表达量在分化程度为I~II级的肝癌组织中显著高于III~IV级(p<0.05)。65例肝癌组织中AKR1B10阳性表达率为76.9%,明显高于本组患者术前血清AFP阳性率(55.4%,p<0.05)。在28例术前血清AFP阴性的肝癌组织中,21例(75.0%)显示为AKR1B10表达阳性。卡方检验显示AKR1B10在肝癌患者组织中的表达与术前血清AFP无相关性(p>0.05)。AKR1B10蛋白在人正常肝、癌旁肝及肝癌组织中的表达依次升高,在肝癌尤其是血清AFP阴性的肝癌组织中表达率较高,这些特点提示它在肝癌的早期诊断和预后评估等方面具有潜在的临床应用价值。结论1.应用γ-GT组织化学染色和HE染色相结合的办法有助于识别和准确获取大鼠肝癌前病变组织用于比较蛋白质组学研究,从而实现动态观察肝癌形成过程中差异表达蛋白。2.本研究通过2-DE和质谱技术筛查出的一系列与肝癌相关的差异表达蛋白质,尤其是那些在肝癌前病变阶段即出现表达水平改变的蛋白,有可能成为新的诊断早期肝癌的分子标志物或防治靶点。3. AKR1B10可能通过调节相关基因的表达来影响细胞的增殖和凋亡能力,从而在肝癌的发生发展过程中发挥作用。AKR1B10在人和大鼠肝癌形成过程中表达逐步上调、在术前血清AFP阴性的人肝癌组织中高表达等特点,提示它对预测肝癌的发生有一定的临床应用价值,有可能成为肝癌早期诊断的新分子标志物或防治靶点。潜在应用价值1. AKR1B10有可能成为新的肝癌早期诊断的分子标志物,丰富了肝癌诊断指标的选择与组合,有助于提高肝癌早期诊断率。2.初步探讨了AKR1B10在肝癌发生发展中的作用和机制,有助于肝癌病理机制的阐明,为肝癌的预防和治疗提供了值得进一步研究的分子靶点。创新点1.应用γ-GT组织化学染色和HE染色相结合的方法识别和获取大鼠肝癌前病变组织,为动态观察肝癌发生过程中蛋白质表达谱的变化提供了准确有价值的标本。2.获得了DEN诱发的大鼠肝癌前病变组织和肝癌组织的蛋白质表达谱,共筛选出82种差异表达蛋白质,其中部分蛋白质在肝癌相关研究中为新报道。3.探讨了AKR1B10的肿瘤相关生物学功能和机制,发现AKR1B10可能通过调节某些基因的表达水平来参与肝癌的发生发展。AKR1B10在大鼠及人的肝癌形成过程中的动态差异表达模式使其有可能成为肝癌的早期诊断标志物或防治靶点。