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目的:构建针对HSV-2的UL27和UL54的双sh RNA质粒表达载体,探讨双sh RNA表达载体对双靶基因的干扰作用以及对HSV-2病毒增殖的影响。方法:利用p Genesil10-3p质粒构建的靶向UL27、UL54的双sh RNA质粒表达载体(Dual-sh RNA),靶向UL27的单sh RNA质粒表达载体(UL27-sh RNA)和靶向UL54的单sh RNA质粒表达载体(UL54-sh RNA),通过脂质体转染HEK293细胞,采用荧光显微镜观察转染效果,并对转染后细胞接种HSV-2病毒。24 h后采用MTT法检测细胞存活率;终点滴定法检测细胞上清液中病毒滴度;QPCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)检测UL27和UL54的m RNA的表达水平;蛋白印迹法检测g B和ICP27蛋白表达量,比较双sh RNA质粒表达载体介导双基因干扰与UL27-sh RNA+UL54-sh RNA联合介导的双基因干扰以及单基因干扰对UL27、UL54的抑制效果,探讨双sh RNA质粒表达载体对HSV-2病毒增殖的影响。结果:(1)MTT法检测结果表明,单基因干扰组UL27-sh RNA、UL54-sh RNA均能不同程度提高细胞存活率,分别为78±2.65%,68.67±3.21%;联合干扰和Dual-sh RNA组的细胞存活率最高,分别为91.67±1.53%、90.33±1.15%;联合干扰、Dual-sh RNA、单干扰组同阴性对照组相比具有显著差异(P<0.05),联合干扰组与Dual-sh RNA组之间无显著差异。(2)终点滴定法测定结果显示,各干扰组子代病毒滴度均有不同程度降低,单干扰组UL27-sh RNA、UL54-sh RNA的子代病毒滴度分别为10-3.2±0.3、10-3.4±0.1;联合干扰组和Dual-sh RNA作用较为明显其子代病毒滴度分别为10-2.07±0.15、10-2.2±0.26,与单干扰组及空白组相比均具有显著差异(P<0.05),联合干扰组与Dual-sh RNA组之间无显著差异。(3)QPCR检测结果,各干扰组中UL27和UL54m RNA表达水平均有不同程度降低,联合干扰组抑制率为85.3±1.53%和81.3±6.51%;Dual-sh RNA抑制率为84±1%和87.7±2.08%,分别与单干扰组及阴性对照组相比具有显著差异(P<0.05),联合干扰组与Dual-sh RNA组之间无显著差异。UL27-sh RNA组中UL27 m RNA表达抑制率为65.3±2.52%;UL54-sh RNA组中UL54 m RNA表达抑制率为71.6±3.51%,分别与空白对照组相比均有显著差异(P<0.05)。(4)WB检测g B和ICP27蛋白表达量,结果显示各干扰组能不同程度降低靶基因蛋白表达量,双干扰组中目的蛋白表达量明显降低,与单干扰组相应蛋白表达量相比具有显著差异(P<0.05),联合干扰组与Dual-sh RNA组之间同一目的蛋白表达量无显著差异。结论:双sh RNA质粒表达载体能够有效地抑制HSV-2目的基因表达;双sh RNA质粒表达载体介导的双基因干扰与两种单sh RNA质粒表达载体介导的双基因干扰对HSV-2病毒复制的抑制效果相同;双基因干扰优于单基因干扰对HSV-2病毒的抑制作用。