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研究背景胃癌（Gastric cancer）是危害人类健康的高发肿瘤之一,我国胃癌发病率达（5～40）/10万,因此对其病因发病学研究对于该肿瘤的防治意义重大。迄今为止,已在直肠癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌等多种人类肿瘤组织中发现DNA聚合酶β（DNA polymeraseβ,polβ）基因的表达增高和/表达异常。胃癌病因复杂,推测在胃癌的发生发展过程中一定伴有DNA的损伤修复。研究表明胃癌组织中polβ突变率为23.7%（9/38）,polβ在低分化胃癌中的突变率高达57.1%,明显高于在中、高度分化胃癌中的突变率4.2%,提示胃癌组织中存在polβ突变,且该突变与胃癌的分化程度有关。polβ是一种重要的DNA修复酶,广泛分布于哺乳动物细胞内,其主要功能被认为是参与DNA修复,在碱基切除修复（BER）过程中填补单核苷酸缺口,包括短补丁（单一核苷酸）BER途径和/或长补丁（几个核苷酸合并）BER途径,是目前已知碱基切除修复（BER）中最重要的聚合酶之一。该酶在哺乳类动物细胞的同源性以及在结构进化中的高度保守性说明它在生命活动中起着重要作用,有人称其为生物进化过程的“看家酶”,其缺陷与一些肿瘤的发生有关。近年来许多学者对polβ在肿瘤组织及细胞系中的突变及表达状态进行了系统研究,然而肿瘤组织中polβ的功能研究国内尚未见报道。因此,探讨胃癌组织中polβ的功能将为揭示肿瘤发生的分子机制提供新的理论依据。实验目的研究胃癌组织中发现的突变型polβ在DNA修复过程中的功能变化,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。实验方法1.重组质粒pET28a（+）-polβ的构建及鉴定利用聚合酶链反应（PCR）和分子克隆技术,以野生型和突变型polβ基因为模板扩增后,构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a（+）表达载体中,构建pET28a（+）-polβ重组质粒并PCR鉴定。2.IPTG诱导表达重组polβ及鉴定取过夜培养的含有pET28a（+）-polβ重组质粒的BL21（DE3）菌接种于5mlLB液体培养基中,37℃振荡培养过夜至饱和浓度,取饱和培养物加入含卡那霉素的10mlLB液体培养基中,37℃培养2h,在实验组的10ml培养基中加入12.5μlIPTG至终浓度为1mmol/L,继续37℃诱导培养5h。超声破碎细胞,并通过紫外分光光度法测定蛋白含量。然后15%SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250染色,甲醇-冰醋酸脱色并观察,采用凝胶分析系统扫描,分析SDS-PAGE后凝胶上的染色条带。3.亲和层析纯化polβ蛋白通过HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化polβ蛋白。4.DNA底物的合成设计合成带有HindⅢ酶切位点的单碱基缺失DNA底物的三条单链P1、P2和P3,退火后合成含有一个碱基缺失的DNA底物。5.BER修复实验按比例分别稀释纯化后的polβ蛋白,观察其对于含有一个碱基缺失的DNA底物的修复作用,并用HindⅢ酶切鉴定。实验结果1.重组表达载体pET28a（+）-polβ经PCR鉴定,证实载体构建成功。2.重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后,用IPTG诱导外源基因表达。表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示,在相对分子质量约为39KD的蛋白条带处,诱导重组菌明显亮于未诱导重组菌,与预期的融合蛋白大小相符。3.通过HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化诱导后polβ蛋白发现,在相对分子质量约为39KD处,野生型polβ和突变型polβ均显示有蛋白条带。4.三条单链P1、P2、P3退火后合成含有一个碱基缺失的56bp的DNA底物,与预期大小相符。5.在BER实验中,1:4稀释纯化后的polβ蛋白时,野生型polβ1和突变型polβ2能将DNA底物修复,并被HindⅢ切开成为27bp和28bp的两个短片段,突变型polβ3不能或部分将底物修复,DNA底物仍为或部分为56bp的长链;1:8和1:16稀释蛋白时,野生型polβ1能将DNA底物修复,并被HindⅢ切开成为27bp和28bp的两个短片段,突变型polβ2和突变型polβ3不能或部分将底物修复,DNA底物仍为或部分为56bp的长链。结论与胃癌组织中的野生型DNA聚合酶β相比,胃癌组织中发现的突变型DNA聚合酶β在碱基切除修复过程中的作用明显减弱。