酮病是围产期奶牛高发的能量代谢障碍性疾病,其会引起免疫功能抑制,导致产后感染性疾病的风险增加。中性粒细胞是机体抗感染免疫的前线,其通过释放胞外诱捕网（NETs）捕获并杀灭入侵机体的病原微生物。酮病奶牛外周血中高浓度的β-羟基丁酸（BHB）可以抑制NETs形成,可能是造成奶牛免疫抑制的重要原因。然而,BHB抑制奶牛NETs形成的机制尚不清楚。本研究选取了5头健康的围产期奶牛（产后3周内）,分离得到外周血中性粒细胞后使用临床浓度（3 m M）BHB孵育不同时间。蛋白免疫印迹结果显示,BHB刺激4 h后瓜氨酸化组蛋白3（Cit-H3,一种NETs激活的标志物）蛋白丰度显著降低。佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）是一种常用的体外NETs诱导剂。在有无PMA处理的情况下,BHB处理均能够显著降低Cit-H3和蛋白精氨酸脱胺酶4（PAD4）的蛋白丰度,同时增加中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的蛋白丰度。荧光显微镜和扫描电子显微镜结果显示,BHB处理限制PMA诱导的NETs形成。通过对NETs的定量分析显示,BHB处理还降低了细胞培养上清中的双链脱氧核糖核酸（ds DNA）含量,进一步证实了BHB对NETs释放的抑制作用。活性氧（ROS）是NETs形成的重要调控分子,中性粒细胞内的ROS绝大多数由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）产生。BHB处理降低了细胞内ROS水平、p47phox的磷酸化水平和Rac2的蛋白丰度,表明BHB抑制NETs形成可能是由NOX途径的ROS产生减少所引起。磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信号通路是NOX的上游调控因子,BHB处理后PI3K的磷酸化水平显著降低。为了证实PI3K信号通路是否参与调控BHB抑制NETs过程,本研究使用了一种有效的PI3K信号通路激活剂740Y-P。蛋白免疫印迹实验和流式细胞术实验结果显示740Y-P缓解了BHB对NOX活化以及产生ROS的抑制作用。荧光显微镜结果显示740Y-P还缓解了BHB对NETs形成的抑制作用以及其对Cit-H3和PAD4蛋白丰度的影响。总之,本研究发现临床浓度的BHB通过抑制PI3K信号通路介导的NOX途径ROS的产生,从而抑制NETs形成。本研究成果为酮病奶牛免疫抑制的分子机制的阐明和防治产品的研发提供了一定的理论基础。