论文部分内容阅读
研究目的控制牙周感染、修复牙周组织缺损是牙周病临床治疗的终极目标。然而,牙周病患者由于牙周组织的局部炎症环境成为影响牙周骨组织再生的一大障碍。本研究尝试利用慢病毒载体携带Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)基因对犬骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)进行转染,观察TLR2基因修饰后的BMSCs对炎症刺激因子的反应,并探讨TLR2基因修饰对骨再生相关的成骨成血管信号通路的调控机制,最终利用携带TLR2的慢病毒液来转染BMSCs并复合I型胶原凝胶构建组织工程复合物,对模拟牙周炎环境造成的比格犬下颌前磨牙牙周骨缺损进行修复评价。材料与方法1.贴壁法培养犬BMSCs,采用流式细胞术对BMSCs表面干细胞标志物进行鉴定;将BMSCs分别使用成骨、成软骨、成脂诱导培养液进行三向诱导分化培养,并进行染色鉴定。2.构建携带TLR2及GFP的慢病毒病毒液(Lv-TLR2及Lv-GFP)及体外转染犬BMSCs,免疫荧光染色及Western免疫印迹检测BMSCs表面TLR2基因的表达。3.炎症刺激因子肽聚糖(peptidoglycan,PGN)作用于转染Lv-TLR2、Lv-GFP后的BMSCs,RT-PCR检测细胞成骨基因Runx2、ALP、OCN以及成血管基因VEGF的表达;进行ALP活性的染色检测,免疫荧光染色观察成骨分化后期标志物OCN的蛋白表达。4.构建BMSCs/PGN/胶原凝胶复合物,移植于裸鼠皮下4周后,免疫荧光染色观察裸鼠皮下异位血管化诱导及干细胞成骨向分化效果。5.建立犬下颌前磨牙牙周炎动物模型。拔除患牙后,于拔牙窝内注射犬BMSCs/胶原凝胶复合物,采用序贯荧光标记和硬组织切片等手段评估炎症环境下骨的再生效果。研究结果1.贴壁法成功分离、培养出犬BMSCs。经流式细胞仪鉴定所培养的BMSCs符合间充质干细胞特性,且纯度较高,可成功被诱导向成骨、成软骨和成脂肪方向分化,表明具有多向分化潜能。2.免疫荧光染色以及Western免疫印迹均证实,BMSCs经Lv-TLR2转染后,能够稳定表达TLR2目的蛋白。3.在PGN刺激下,BMSCs的成骨及成血管基因表达稍增高,但无统计学差异;转染TLR2后,成骨、成血管基因表达进一步增高,显著高于未转染组(P<0.05或P<0.01)。另外,在PGN刺激下,转染TLR2细胞组ALP染色强阳性。同样,在PGN刺激下,Western blot检测发现,TLR2过表达,骨髓干细胞中Hif-1α、VEGF和BMP2均明显上调;OCN免疫荧光检测结果也提示,PGN+BMSCs-TLR2组表达量最高。4.裸鼠皮下移植细胞材料复合体试验证实,BMSCs/胶原凝胶具有异位成骨、成血管能力,而TLR-2基因的转染大大增强了成骨效果。5.将胶原凝胶包被TLR2基因转染的BMSCs注射到牙周炎患牙拔牙窝内,实验结果提示TLR2基因修饰的BMSCs能够更快、更多地形成新骨,缺损修复效果更好。研究结论PGN可通过TLR2受体促进BMSCs血管化骨再生,产生理想的骨修复效果。这一技术可进一步应用于感染、缺氧等恶劣条件下骨缺损的再生修复,为未来进入临床应用奠定了基础。