在亲缘性较近的细菌中,那些只存在于致病菌而不存在于非致病菌的基因往往具有重要的生物学意义.本实验通过抑制消减杂交技术,以致病性问号钩端螺旋体赖株为tester,非致病性双曲钩端螺旋体57001株为driver,比较致病与非致病钩端螺旋体之间基因组的差异,从而筛选出致病钩端螺旋体特有的基因片段.经两轮消减杂交和PCR后,获得的消减混合物克隆入pMD18-T载体中建立消减杂交文库.经dot blot筛选鉴定阳性克隆,并进行测序及同源分析.用PCR方法验证所得的基因为问号钩端螺旋体赖株所特有,而在双曲钩端螺旋体57001株中不存在.用dot blot方法鉴定上述基因在不同致病和非致病钩端螺旋体中分布的情况.结果显示在随机挑取的188个克隆中,有24个克隆含有tester株特异的基因序列,其中5个克隆含有的序列为非编码区,剩下的19个克隆含有23个不同的蛋白编码序列.在这23个蛋白编码序列中,1个编码亮氨酸富含序列家族蛋白,1个编码外膜蛋白, 9个编码与代谢和物质转运相关蛋白,其余12个编码功能未知蛋白.经dot blot检测发现上述23个赖株特异基因存在于赖株及其他大部分致病性钩端螺旋体中,不存在于非致病性钩端螺旋体中. Ⅰ本部分研究结果显示抑制消减杂交技术是在两株钩端螺旋体间筛选特异基因的有效方法,筛选到的一些赖株特异基因可能与毒力有关.进一步探讨这些基因的生物学功能将对钩端螺旋体的致病机制的研究提供重要信息。 Ⅱ利用DNA芯片检测不同问号钩端螺旋体基因组差异钩端螺旋体病为人兽共患病并呈全球分布,人通过接触污染钩端螺旋体的水源或土壤而感染.问号钩端螺旋体赖型和哥本哈根型全基因组测序的完成使我们能以此为基础制备基因组DNA芯片,并用比较基因组杂交(CGH)的方法来分析问号钩端螺旋体基因组差异.本研究中所用的芯片含有赖株3528个开放阅读框架(ORF),应用该芯片我们检测到有275个基因在11个检测菌中至少有一株菌中缺失,问号钩端螺旋体中约有2917个核心基因.芯片杂交结果显示,编码基础细胞功能的基因如复制、转录和翻译相关基因较保守.赖株特异基因主要包括那些编码细胞表面结构基因、碳水化合物转运和代谢相关基因.同时,利用芯片杂交技术和生物信息学方法在赖株中发现了2个基因岛(GI),这两个基因岛中含有大量赖株特异基因,这些基因可能与问号钩端螺旋体赖株强致病性有关.芯片结果还显示,不同血清群钩端螺旋体的0抗原合成相关基因存在不同,可以此为基础发展并研制快速分型技术.上述赖株特异性基因为深入研究问号钩端螺旋体的致病机制以及研制新型的钩端螺旋体病诊断方法或钩端螺旋体疫苗提供了信息支持。