结肠癌相关成纤维细胞原代培养及对结肠癌细胞增殖侵袭能力的影响

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[目的]探讨原代培养及纯化后的结肠癌相关成纤维细胞(cancer associatedfibroblast,CAF)对结肠癌细胞增殖及侵袭能力的影响,为研究癌细胞微环境在结直肠癌发生发展过程中的作用,并进一步用于结直肠癌的预防及寻求新的治疗途径而奠定基础。[方法]采集手术切除结肠腺癌及正常结肠粘膜标本进行原代培养,电镜及免疫组化初步分析鉴定,获得纯化的结肠CAF及结肠粘膜正常成纤维细胞(Normalfibroblast,NF)进行传代培养。分别利用CAF及NF条件培养基培养HCT-116细胞,用无血清培养基培养HCT-116细胞作为对照,通过MTT法检测HCT-116细胞株的增殖能力的变化(A组);利用Transwell小室,建立CAF及NF与结肠癌细胞HCT-116细胞株间接共培养模型,同时用10%完全培养基培养HCT-116细胞作为对照,观测在CAF及NF作用后的HCT-116细胞形态学改变,利用流式细胞仪分析HCT-116细胞的增殖周期(B组);再以Matrigel胶模拟重建基底膜,观测CAF对HCT-116细胞侵袭能力的影响(C组)。[结果]培养纯化的结肠CAF较NF异型性明显,生长活跃,接触抑制和密度抑制丧失,结肠CAF及NF广谱角蛋白均表达阴性,波形蛋白阳性,CAF的α-SMA表达阳性,NF则阴性,CAF见肌丝等超微结构,而NF除线粒体丰富外未见明显肌丝结构;间接共培养模型提示结肠CAF对HCT-116细胞的形态学变化不明显;CAF条件培养基培养的HCT-116细胞增殖活性增高,MTT实验显示24h、48h、72h时CAF条件培养基组的HCT-116增殖活性与其余两组相比差异均有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪分析结果表明,CAF间接共培养的HCT-116,G2期和S期的细胞所占比例较NF间接共培养组和10%完全培养基培养组均明显升高,差别有统计学意义(P<0.05)。侵袭实验CAF作用下的HCT-116细胞侵袭能力明显增强,与其他两组相比,差别均有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.建立原代培养的结肠癌相关成纤维细胞(CAF)和结肠粘膜正常成纤维细胞(NF)模型,为进一步研究结肠癌细胞微环境对结肠癌发生发展中的作用、机理的研究、结肠癌预防和寻求新的治疗途径创造了条件;2.CAF具有促进结肠癌细胞HCT-116增殖及增强其迁移侵袭的能力;3.CAF条件培养基中可能存在一些可溶性活性物质具有促进HCT-116细胞增殖及侵袭能力的作用。
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