普鲁兰酶属于糖基水解酶第13家族,也称为α-淀粉酶家族。这类酶广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。根据其作用底物特异性和产物的种类不同,普鲁兰酶被划分为三种：Ⅰ型普鲁兰酶、Ⅱ型普鲁兰酶和Neopullulanase。本研究以来源于厌氧芽胞杆菌Anoxybacillus sp. LM18-11的普鲁兰酶PulA（F）为研究对象,该普鲁兰酶全长基因2,121 bp,编码707个氨基酸,分子量为82.737 kDa,与好热黄无氧芽孢杆菌Anoxybacillus flavithermus WK1基因组中的Aflv₀438基因编码的一个Ⅰ型普鲁兰酶氨基酸序列约82.94%同源。对其进行外源表达,并通过对其酶学性质进行了研究,分析得知其最适反应pH为6.0,最适反应温度为60℃,在55℃,60-C和65。C条件下,半衰期分别为70 h,48 h和1.5 h,Vmax和Km值分别为750 U/mg和1.47mg/mL,是目前国内文献报道中比活力最高的,因此认为是一种新型的普鲁兰酶。从晶体结构分析结果可知,普鲁兰酶Pu1A（F）的结构分为N1、N2、A、C四个结构域,结构域A为催化活性中心。在单独缺少结构域N1的情况下,普鲁兰酶PulA（-N1）能够形成正确折叠的可溶性蛋白。而酶学性质分析得知PulA（-N1）的最适反应pH为6.0,最适反应温度为55℃,Vmax和Km值分别为324U/mg和1.95mg/mL,在55℃,60℃和65℃条件下半衰期分别为10 h,2 h,0.5 h。由于普鲁兰酶最适反应pH为6.0,虽然其具有较强的热稳定性,仍与工业生产过程pH 4.5的需要有一定差距,因此,为了降低其最适反应pH,利用易错PCR方法对普鲁兰酶PulA进行定向进化,确定最适突变条件为Mg2+3 mmol/L、Mn2+0.05 mmol/L,在此条件下的平均突变率为0.24%,并建立了普鲁兰酶突变株的高通量筛选方法。为了普鲁兰酶的外源表达,本实验构建了pBE980-pulA表达质粒,并以枯草芽孢杆菌WB600作为宿主实现了普鲁兰酶的外源表达,并对培养基成分进行了优化,获得了枯草芽孢杆菌WB600异源表达普鲁兰酶PulA的最优培养基组分,使普鲁兰酶产量在100 mL摇瓶中达到333.198 U/mL