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我国是世界上贝类人工育苗规模最大、增养殖产量最多的国家,这些贝类中大部分是海洋双壳类,保护这些原始优良种质,并利用这些优良的种质资源培育新品种、新品系,对海洋产业可持续发展具有战略意义。种质遗传资源的有效保护和合理利用依赖于对其遗传特性的研究,开展海洋双壳类群体遗传学研究不仅具有重要的理论意义,而且具有重要的应用价值。本文利用rDNA的ITS2序列、SSR技术和mtDNA的16S rRNA与COI基因片段序列等几种分子遗传学标记,探索研究西施舌(Coelomactra antiquata)、文蛤(Meretix meretrix)、四角蛤蜊(Mactraquadrangularis)及毛蚶(Scapharca subcrenata)等四种重要海产经济双壳类(Bivalve)的群体遗传特性,为这些海洋贝类资源的科学保护和合理利用提供科学依据。本研究取得的主要结果如下:
一、西施舌的种群遗传多样性研究
测定了5个不同群体133个样本的西施舌rDNA的ITS2(second internaltranscribed spacer region)序列,分析了该物种的群体遗传结构,同时利用线粒体16S rRNA基因序列片段进一步比较比较了群体间的遗传变异状况。
1、ITS2序列的群体间及群体内遗传变异的比较结果显示:1)ITS2序列的PCR扩增产物长度为523~537 bp,ITS2非编码区序列全长为389~401bp,平均GC含量为59.7%,多态性变异位点28个,其中简约信息位点18个,另外有15个位点的插入/丢失;序列的核苷酸多态性Pi为1.99%。2)5个群体共得到38个单元型,单元型的多态性(Hd)为89.3%,共享单元型7个,各群体均有其特有单元型(GenBank登录号:FJ827075-FJ827079),其中,长乐群体特有单元型最多,共22个;以Kumura-2-P法构建了群体间的NJ树、UPGMA树及ME树,以及用Network软件构建了单元型间的系统网络关系图,系统聚类分析得出:长乐群体与北方4个群体(QD、GY、RZ及JM)之间已存在明显遗传分化(遗传距离d=0.029-0.032,遗传分化指数FST=0.6617-0.6398),北方4个群体间没有明显遗传差异(FST<0)。
2、PCR扩增16S rRNA基因片段的序列长度为450bp,分析群体间的系统发生关系,得到与ITS2系统树相一致的结果:1)不包括长乐群体在内的其它群体间的遗传距离为0.0~0.007;2)长乐群体与其它几个群体间有明显遗传分化,以线粒体的分子钟进化速率每百万年2%为标准(Brown et al.,1979),群体的分化时间在3.33Myr以前;3)群体间的遗传距离d=0.077-0.081,序列的核苷酸差异度为6.67%。
依据这两种序列的分析结果,从资源的保护与利用上长乐群体与北方群体应分别作为不同的管理单元;依据与其它相关研究分析比较,推测长乐群体可能为一个地理亚种;研究表明ITS2序列作为西施舌群体遗传结构的分子标记是可行的。
二、毛蚶、文蛤及四角蛤蜊的微卫星(Simple Sequence Repeats,SSR)标记筛选及群体遗传多样性分析
1、毛蚶的SSR筛选与群体遗传多样性研究结果:1)共得到阳性克隆29个,其中有24个重复次数在5次以上的微卫星序列,除探针中使用的CA及GA重复外,还得到CG重复序列,其中(CA)n类型最多,四核苷酸重复有:TATC和TTTC;2)获12对多态性微卫星引物标记,GenBank登录号为:EU483140-EU483151;3)PCR扩增毛蚶江苏群体,分析得到12个位点的多态信息含量(PIC)普遍很高,只有N263位点的PIC值较低(PIC=0.342),其它位点的PIC值均大于0.5(0.619~0.926),位点的平均等位基因数为12.4,群体的观察杂合度(H0)的范围:0.182~0.917,期望杂合度(HE)为0.422~0.947。4)用GENEPOP软件分析表明各位点没有存在连锁不平衡(LD),有5个位点偏离哈迪一温伯格平衡(HWE),经检验这些偏分离均是由于无效等位基因引起的杂合子缺失所致。5)用这些多态性引物跨种扩增了文蛤、四角蛤蜊及西施舌等3种海洋经济贝类,其中有7对引物得到扩增产物。
2、文蛤SSR的研究结果:1)共得到49个重复次数在5次以上的微卫星序列,两核苷酸重复的类型有:CA、GA及CG等3种重复序列类型,四核苷酸重复类型有14种,其中(TACA)n的重复次数达100;2)挑选、设计16对引物,PCR扩增共得到12对有多态性,GenBank登录号为FJ232978~FJ232989;3)扩增文蛤江苏自然群体,结果表明各位点的PIC值普遍很高,只有WG347位点的PIC低于0.5(PIC=0.42),位点的等位基因数在4~16之间,群体的H0为0.154~0.773,HHE为0.486~0.843;4)软件分析表明这些位点间没存在LD,有5个偏离HWE,P值经过顺序Bonferroni校正有2个位点偏离HWE,这些偏分离均为无效等基因导致的杂合子缺失所造成。
3、四角蛤蜊SSR的研究结果:1)共得到36个重复次数大于5或重复序列长度12bp以上的微卫星序列,其中,双核苷酸重复有CA及GA两种类型24个序列,其它类型有:5个四核苷酸重复,10个五核苷酸重复,还有六核苷酸重复、八核苷酸重复、十核苷酸重复及十三核苷酸重复各有1个;2)设计引物12对,其中8对具多态性,GenBank登录号为EU924148~EU924155;3)扩增江苏群体28个样本,结果表明各位点的PIC值均高于0.5,各位点的平均等位基因数为9.75,群体HO的范围为:0.040~1.0,HE为:0.040~0.940;4)用GENEPOP 3.4软件分析表明6对符合HWE,各位点没有存在LD,有两个位点偏分离也为无效等位基因所致的杂合度不足造成。
三、基于mtDNA COI基因序列片段的四角蛤蜊群体遗传多样性研究
共扩增26个个体的线粒体基因COI序列,通过分析研究了四角蛤蜊自然群体的遗传多性,结果如下:1)共获得长度为626bp的COI序列片段26个,获22个单元型,单元型多态性为0.978;2)序列有36个多态位点,平均核苷酸差异为4.846;3)该COI基因片段序列的碱基组成分别为:0.218(A),0.441 (T/U),0.146(C),和0.195(G)。
全文研究结论:1)西施舌不同地理分布的群体均具有较高的遗传多样性水平,其中江苏至山东的4个自然群体间没有遗传分化,长乐群体与上述4群体间遗传分化明显,遗传差异已达亚种水平,在资源保护与利用上应作为不同的管理单元;2)首次从文蛤、毛蚶与四角蛤蜊中筛选得到32个多态性微卫星标记,用这些标记分析表明了3种双壳类的江苏群体均具有较高的遗传多样性水平;首次毛蚶的微卫星标记在不同亚纲的3种贝类均有跨种扩增产物,表明这些微卫星标记将在双壳类的群体遗传学等研究发挥重要作用。