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背景:脑血管疾病是危害人类健康,威胁人类生命的主要疾病之一。我国每年新增脑血管疾病患者约有250万。缺血性脑卒中（Ischemic stroke,IS）指的是因脑部血液循环受到阻碍,导致脑部缺氧、缺血所致脑组织缺血性坏死,占脑卒中的80%左右,该病致残致死率高,耗费大量社会和医疗资源,给患者带来极大的身心痛苦。目前缺血性脑卒中的核心治疗方法是血管再通,在有效的时间内进行静脉溶栓治疗,可以降低灌注临界状态的缺血半暗带区细胞的死亡,从而减轻患者神经功能障碍,降低死亡率,然而脑卒中患者早期诊断条件和治疗时间有限,只有少数患者能够接受血管再通手术治疗。因此,在分子水平上探索缺血性脑卒中的早期诊断及治疗的靶标尤为重要。基于高通量测序技术的发展,大多数研究均以小分子RNA为出发点,比如miRNA,lnc RNA和circ RNA。miR-143-3p是一种与多种疾病相关的miRNA,有研究显示缺血性脑卒中患者细胞外囊泡中的miR-143-3p表达水平明显高于健康对照组,揭示miR-143-3p与脑卒中可能有某种关系。但是在研究中仅仅考虑miRNA和脑卒中的关系太过片面,而且临床实验显示,单纯使用miRNA治疗脑卒中的效果并不理想。近年来,研究者发现circ RNA与miRNA有结合位点,可以与mRNA竞争性结合miRNA,从而抑制miRNA调控mRNA作用。大量数据显示circ RNA-miRNA-mRNA调控网络失衡会影响神经性疾病的发生发展,同时脑卒中会引起细胞发生内质网应激,并导致神经细胞凋亡和坏死,这些将会直接加重脑部损伤。目的:本课题利用生物信息学技术,筛选神经细胞中miR-143-3p相互结合的circ RNA与mRNA,建立神经细胞中circ RNA-miRNA-mRNA调控网络,并在脑卒中细胞及动物模型中对其进行功能研究,结合内质网应激与自噬探讨circ RNA-miRNA-mRNA调控网络影响脑卒中损伤相关机制,为脑卒中的早期诊断及临床治疗提供理论基础。方法:1.生物信息学筛选miR-143-3p相互结合的circ RNA与mRNA,以SK-N-SH细胞为研究对象,设立空白对照组（Control组）和miR-143-3p组,应用q RT-PCR技术验证候选circ RNA和mRNA,筛选miR-143-3p相结合的circ RNA、mRNA。2.A172和SK-N-AS细胞构建氧糖剥离（Oxygen and glucose deprivation,OGD）模型,SD大鼠构建大鼠中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,分别使用miR-143-3p inhibitor慢病毒,circ＿0025984慢病毒或者miR-143-3p mimics慢病毒+circ＿0025984慢病毒调控细胞内circ＿0025984与miR-143-3p的表达,采用q RT-PCR、western blotting、免疫荧光和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测等实验技术验证circ＿0025984/miR-143-3p/TET1调控网络在脑卒中细胞模型的表达及功能。3.以A172细胞为研究对象,FISH,AGO2 pull down以及双荧光素酶实验手段验证miR-143-3p与circ＿0025984和TET1的靶向结合。4.以A172细胞为研究对象,构建OGD模型,分别使用miR-143-3p inhibitor慢病毒,circ＿0025984慢病毒、miR-143-3p mimics慢病毒+circ＿0025984慢病毒调控细胞内circ＿0025984与miR-143-3p的表达,同时过表达circ＿0025984后分别加入ATG7/si-ATG7,WB检测GRP78,LC3-II/LC3-I和ORP150表达,验证Circ＿0025984/miR-143-3p/TET1调控网络是否通过内质网应激与自噬介导脑卒中神经细胞凋亡。5.以A172细胞为研究对象,分别使用TET1/si-TET1质粒调控TET1表达,q RT-PCR、western blotting、CHIP实验检测TET1与ORP150调控关系;生物信息学查找ORP150基因启动子序列及Cp G岛区域后MSP检测细胞ORP150甲基化水平;使用5-Azac调控细胞甲基化水平后,western blotting检测ORP150、LC3-II/LC-I、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达;细胞内过表达TET1或者过表达ORP150,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,验证TET1影响脑卒中发展及相关机制研究。结果1.通过生物信息学分析筛选出与miR-143-3p能够结合排前十位的circ RNA与mRNA,q RT-PCR实验结果显示过表达miR-143-3p后,circ＿0025984与TET1表达显著降低（P<0.001）。2.与正常组相比,OGD模型组中miR-143-3p表达明显升高,circ＿0025984与TET1基因表达水平明显降低（P<0.001）;敲低miR-143-3p或者过表达circ＿0025984后,TET1蛋白表达升高（P<0.05）,细胞凋亡水平降低（P<0.001）;而过表达miR-143-3p的同时过表达circ＿0025984,TET表达降低,细胞凋亡水平升高。3.circ＿0025984和miR-143-3p主要分布在A172细胞的细胞质中,且表达丰度均较高;AGO2组circ＿0025984与miR-143-3p均有表达,且表达显著高于Ig G组（P<0.001）;过表达miR-143-3p后,野生型circ＿0025984 3’UTR和野生型TET13’UTR荧光信号降低,而突变组荧光信号不变。4.敲低miR-143-3p或者过表达circ＿0025984后,细胞自噬和内质网应激水平降低,自噬和内质网应激蛋白表达降低;而过表达miR-143-3p的同时过表达circ＿0025984,细胞自噬和内质网水平升高,自噬和内质网应激蛋白升高;进一步研究发现过表达circ＿0025984的同时,抑制ATG7表达,细胞内LC3-II的表达水平不变,而过表达miR-143-3p降低ORP150表达,过表达circ＿0025984后,增加ORP150的蛋白水平。5.过表达TET1能促进ORP150的基因和蛋白表达,而降低TET1能降低ORP150基因和蛋白表达,CHIP结果显示TET1蛋白与ORP150启动子区域结合;MSP实验结果显示,OGD组ORP150基因甲基化水平上升,而过表达TET1后,ORP150甲基化水平降低;进一步实验证实TET1过表达后,细胞LC3-II,Caspase-3及Caspase-9表达降低,ORP150表达升高,而使用5-氮胞苷处理细胞后,结果与过表达TET1结果一致,同时,过表达TET1能降低细胞凋亡水平,过表达ORP150能很大程度改善细胞的凋亡。结论:本课题通过生物信息学分析挑选出与miR-143-3p相结合的circ＿0025984与TET1,在A172和SK-N-AS细胞OGD模型和SD大鼠MCAO模型中证实,缺血性脑卒中模型中,circ＿0025984表达降低,miR-143-3p表达增加。TET1降低后,内质网应激分子伴侣ORP150启动子去甲基化过程受阻,导致ATG7介导神经细胞自噬、凋亡从而促进缺血性脑卒中发生和发展。