【摘 要】
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目的:本研究旨在检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中肿瘤抑制因子PTEN启动子区甲基化率,探讨PTEN启动子区甲基化的调控机制及其对HCC分子靶向药物敏感性的影响。方法:收集并保存52例接受分子靶向药物索拉非尼(Sorafenib)治疗的HCC患者的肿瘤组织和癌旁组织标本,使用q PCR技术和二代测序(next generation sequencing,
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目的:本研究旨在检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中肿瘤抑制因子PTEN启动子区甲基化率,探讨PTEN启动子区甲基化的调控机制及其对HCC分子靶向药物敏感性的影响。方法:收集并保存52例接受分子靶向药物索拉非尼(Sorafenib)治疗的HCC患者的肿瘤组织和癌旁组织标本,使用q PCR技术和二代测序(next generation sequencing,NGS)技术分别对组织标本中的PTEN m RNA表达水平和PTEN启动子区域的甲基化率进行检测。根据PTEN表达水平或PTEN启动子区甲基化率的中位数将患者分为2组(高水平组和低水平组),通过比较和分析两组患者的进展时间(TTP)和总生存期(OS)评价PTEN启动子区甲基化在HCC中的临床意义。体外培养两种代表性HCC细胞(MHCC97-H和Hep G2),用DNA甲基转移酶1(DNA-methyltransferase 1,DNMT1)抑制剂地西他滨(Decitabine)处理细胞后检测Decitabine对MHCC97-H和Hep G2细胞PTEN启动子区甲基化率和PTEN表达水平的影响,并通过染色质免疫沉淀(Ch IP)检测DNMT-1在PTEN启动子区域的募集。用Decitabine和分子靶向药物联合处理MHCC97-H和Hep G2细胞后,采用MTT法测定细胞IC50值,采用transwell实验检测细胞体外转移或侵袭情况。结果:PTEN m RNA在HCC组织中的表达水平显著低于其在癌旁组织中的表达水平(p<0.05),PTEN启动子区甲基化率在HCC组织中显著高于癌旁组织(p<0.05)。PTEN高表达组患者接受分子靶向药物Sorafenib治疗的预后好于PTEN低表达组患者,两组患者之间的TTP和OS均有统计学差异(p<0.05);PTEN启动子区低甲基化组患者接受Sorafenib治疗的预后好于PTEN启动子区高甲基化组患者,两组患者之间TTP和OS均有统计学差异(p<0.05)。PTEN启动子区的甲基化作用受DNMT-1的调控,Decitabine处理可下调MHCC97-H和Hep G2细胞PTEN启动子区的甲基化水平、上调PTEN的表达水平,并抑制DNMT-1在PTEN启动子区的募集作用。MHCC97-H和Hep G2细胞用Decitabine处理或者直接过表达PTEN均能够显著降低分子靶向药物对细胞的IC50值,Decitabine(5μmol/L)联合Sorafenib(1μmol/L)应用能够显著增强Sorafenib对HCC细胞体外迁移和侵袭的抑制作用。结论:本研究成功建立了基于二代测序的新型PTEN启动子区甲基化水平检测的方法,可用于HCC组织中PTEN启动子区甲基化率的检测。发现PTEN启动子区甲基化率与HCC患者预后负相关。PTEN启动子区甲基化率受DNMT1调控,降低PTEN启动子区甲基化水平可增强HCC细胞对分子靶向药物的敏感性。本研究的结果提示PTEN启动子区甲基化或可作为HCC的诊断指标或治疗靶标。
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