论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2, PCV2）可以引起猪的免疫功能抑制和持续性感染，其引起的猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）是危害当今全球养猪生产的最重要的病毒性传染病之一，目前关于PCV2的致病机制仍然不清楚，因此深入探究PCV2致病机理十分必要。细胞自噬（Autophagy）在病原体感染过程中发挥着重要作用，与病毒的清除和逃避有关。本论文拟揭示PCV2感染诱导宿主细胞自噬的现象，分析细胞自噬在PCV2复制中的作用，旨在从一个新视角为深入研究PCV2的致病机理奠定基础。用PCV2SD/2008株感染或经紫外线灭活后刺激PK-15细胞，运用透射电镜和激光共聚焦免疫荧光技术，分别检测细胞中的自噬囊泡和自噬体标志物LC3分子以及自噬降解底物p62蛋白的表达情况。结果显示，PCV2活毒及灭活后均能诱导PK-15细胞产生大量的双层膜和单层膜的自噬体样囊泡，显著提高自噬体标志分子LC3的表达量，降低自噬底物p62的表达量。进而用PCV2SD/2008株感染5w健康巴马香猪，感染后3、7、28d，在猪的淋巴结中的巨噬细胞和肝细胞胞浆内可见大量自噬囊泡，在肺泡巨噬细胞以及淋巴结、脾脏、肾脏等组织细胞内可检测到自噬体标志物LC3分子表达。上述体外和体内实验结果表明，PCV2可以诱导宿主细胞自噬的发生。为了明确自噬对PCV2复制的影响，在PCV2感染PK-15细胞之前或之后分别应用自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin, Rapa）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）人工改变宿主细胞的自噬活性，然后应用透射电镜、激光共聚焦免疫荧光、Real-time PCR及IPMA等技术检测细胞自噬囊泡、自噬标志分子或PCV2核酸含量，分析自噬对PCV2复制的影响。结果显示，利用Rapa诱导细胞自噬可显著提高PK-15细胞内PCV2核酸含量（P＜0.01）以及病毒滴度（P＜0.01）。表明细胞自噬可促进PCV2在PK-15细胞中的复制。为了进一步验证细胞自噬对PCV2在感染动物内复制的影响，本研究首先应用Rapa和3-MA建立了自噬诱导和自噬抑制的小鼠模型，然后将100只8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组，分别为PCV2感染自噬诱导（PCV2+Rapa）组、PCV2感染自噬抑制（PCV2+3-MA）组、病毒（PCV2）感染组和空白对照（PBS）组，每组25只。于感染后3、7、14、21、28和56d，每组随机剖杀4只小鼠，取肝脏或脾脏检测自噬现象与PCV2载量。结果显示，感染后7、14d在自噬诱导小鼠的脾脏和肝脏混合物内没有检测到PCV2核酸，而于感染后21、28d显著高于自噬抑制组和PCV2单独感染组的含量（P＜0.01）；自噬诱导小鼠肝脏、脾脏等组织中的病毒蛋白信号数量的变化趋势与自噬体标志分子LC3和Beclin信号数量的趋势基本一致。上述实验结果表明，细胞自噬参与了PCV2的感染过程，并对病毒在宿主细胞内的复制及持续感染产生影响。综上所述，本研究证明PCV2感染可诱导细胞自噬，而细胞自噬对PCV2的体外复制有促进作用，自噬有利于动物机体对PCV2的清除，但同时自噬又影响病毒在动物体内的复制和持续感染。