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在绝大多数国家肺癌的发病率和死亡率均呈明显上升趋势,对人类的健康造成极大的危害。2002年全球肺癌的男性发病率约为35.5/10万,发病97万人,死亡率为31.2/10万,死亡85万人;女性发病率为12.1/10万,发病39万人,死亡率为10.3/10万,死亡33万人。自2000年至2005年,我国肺癌发病人数增加约11.6万（自2000年的38.1万增至2005年的49.7万,增长约30.4%,其中男性肺癌发病人数增加7.0万,女性4.6万）;肺癌的死亡人数增加约10.1万（自2000年的32.7万增至2005年的42.8万）,增长约30.9%,其中男性肺癌死亡增加6.1万,女性为4.0万),肺癌的疾病负担、流行病学、病因学、发病机理、早期诊断、预防和临床综合治疗成为各国努力研究的重点课题之一。癌症是一种基因病,是人体细胞在内外环境因素作用下,内在多种原癌基因被激活和/或抑癌基因失活的多阶段长期演变的过程。ING1基因是1996年Garkavtsev等采用改良的cDNA消减杂交方法（substractive hybridization）和体内选择技术（in vivo selection assay）,克隆到的一个新的肿瘤抑制基因,主要编码蛋白p33ING1b,细胞核内表达,主要与p53共同参与基因调控、DNA修复、细胞周期调控、诱导凋亡以及衰老。体内、体外和动物等实验也证实了p33ING1b蛋白的过量表达能够减缓细胞生长,诱导细胞凋亡及促进损伤修复,其低表达则可刺激克隆的形成,促使细胞的恶性转化,导致肿瘤的发生。探讨ING1基因在肺癌发生发展中的作用和机理,进一步揭示ING1基因的生物学功能,丰富和发展肿瘤发生发展理论,为肿瘤早期诊断和治疗提供依据有着十分重要的意义。本课题从三个方面研究ING1基因与肺癌发生发展的关系,探讨ING1基因在肺癌发生发展中可能的作用和机理。第一部分:检测肺癌组织、癌旁组织和非肿瘤肺组织ING1基因主要蛋白产物p33ING1b和其伴侣分子p53的表达水平以及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达,研究三者表达之间的关系以及三者与临床病理特征特别是预后的关系,并用免疫共沉淀的方法检测肺癌组织和细胞中p33ING1b蛋白和p53蛋白是否存在物理性结合;第二部分:检测肺癌组织中ING1基因微卫星不稳定性,主要是杂合性缺失情况,并研究杂合性缺失与蛋白表达及临床病理特征的关系;第三部分:研究ING1基因过表达对肺癌细胞生物学行为特别是细胞周期和凋亡的影响。第一部分:为研究大样本肺癌组织及癌旁组织、非肿瘤肺组织蛋白表达情况,本研究利用组织芯片高通量、便于设置对照并可在同等条件下进行实验的优点,构建组织芯片并进行免疫组织化学染色,检测肺癌石蜡标本p33ING1b、p53和PCNA蛋白表达情况。共构建10张组织芯片,含有928个点,434个癌组织,434个癌旁组织,60个非肿瘤肺组织。免疫组织化学染色p33ING1b蛋白总的表达率为47.0%（102/217）,在鳞状细胞癌、腺癌、细支气管肺泡癌、腺鳞癌、小细胞癌、类癌和粘液表皮样癌中的阳性率分别为66.7%（62/93）、33.3%（23/69）、37.9%（11/29）、15.4%（2/13）、44.4%（4/9）、0%（0/3）和0%（0/1）;其中鳞状细胞癌高于腺癌、腺鳞癌和细支气管肺泡癌,并且有统计学意义（P<0.05）,其余类型间差异无显著性（P>0.05）。217例肺癌中,137例p53阳性,80例阴性。p33ING1b、p53蛋白的表达与肿瘤大小、淋巴结转移数量、有无坏死及临床分期无相关性(（r<0.12, P>0.05）。p33ING1b、p53蛋白与PCNA的表达有相关性,当p33ING1b表达阳性时,PCNA的表达与p53的表达相关（P<0.05）,但当p33ING1b表达阴性时,PCNA的表达与p53的表达不相关（P>0.05）。对217例中100例患者进行随访,健在28例,失访28例,最长者73个月。统计显示,肺癌组织的p33ING1b蛋白表达与生存时间不相关（r<0.20,P>0.05）,p53的表达与生存时间呈负相关（r=-0.23067,P=0.0214）,说明p33ING1b蛋白的表达不能单独作为判断肿瘤的预后的指标。应用免疫共沉淀方法对上述病例中p33ING1b、p53蛋白均为阳性的5例新鲜标本进行检测,没有发现p33ING1b和p53蛋白有物理性结合。第二部分:采用银染PCR-SSCP（Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism）检测76例新鲜冻存肺癌组织及其配对癌旁组织的ING1基因微卫星杂合性缺失发生频率。对上述标本进行DNA抽提,并对ING1基因四个微卫星位点进行PCR扩增。70例具有信息量的肺癌组织在ING1基因的四个微卫星位点D13S261、D13S1047、D13S1315和DS42490的杂合性缺失发生频率分别为20.0%（14/70）、24.3%（17/70）、21.4%（15/70）、40.0%（28/70）,总的发生频率为55.7%（39/70）;位点D13S261、D13S1047、D13S1315之间杂合性缺失发生率差异无显著性（P>0.05）,与位点DS42490即ING1基因内部位点存在显著差异（P <0.05）。统计显示,39例发生杂合性缺失的标本中有23例p33ING1b失表达,8例表达下调,8例阳性。而31例无杂合性缺失的标本,有17例p33ING1b表达,仅有14例失去p33ING1b表达,p33ING1b失表达或低表达与杂合性缺失发生有相关性（P <0.05）。以上结果提示肺癌中ING1基因位点及其附近存在高频率的杂合性缺失,它可能是导致该蛋白表达下调甚至丧失的重要原因,或者影响该蛋白的功能,从而抑癌活性减弱,导致肿瘤的发生。第三部分:研究ING1基因对肺癌细胞系的生长抑制作用。将ING1b cDNA克隆入pcDNA3真核表达载体,采用脂质体转染法将其转染人肺癌细胞株A549和SK-MES-1,观察细胞的生长速度及细胞凋亡情况。为进一步研究p33ING1b与p53间的协同功能对肺癌细胞生物学行为的影响,同时转染ING1b基因和野生型p53基因,观察联合共转染两个基因及单转染基因组间蛋白表达、下游基因p21WAF1蛋白表达、细胞凋亡率和细胞周期的改变。结果显示,转染pcDNA3/ING1b、pCMV/wtp53后A549和SK-MES-1两个细胞株都表现为细胞生长缓慢,G1期延长,S期缩短,并且凋亡率明显升高,同时p21WAF1表达上调,特别是共转染pcDNA3/ING1b+pCMV/wtp53组变化更为明显。应用免疫共沉淀方法对各转染组细胞中p33ING1b和p53蛋白进行检测,发现过表达p33ING1b时存在与野生型p53蛋白有物理性结合。以上结果提示ING1b基因产物可能通过与野生型p53结合,激活下游基因p21WAF1进而诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞生长。结论:通过以上三部分的研究,证实了ING1基因在肺癌组织中存在基因的改变,微卫星位点表现出较高的不稳定性,影响基因的表达;ING1基因主要蛋白产物在肺癌组织中存在较大比例的失表达或低表达,影响着肿瘤的发生与发展;基因转染也进一步证实了ING1基因可以协同p53激活下游基因p21WAF1诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的生长。与广泛研究的抑癌基因p53一样,ING1基因可作为肿瘤的基因治疗靶点,与单一研究p53基因相比具有更加重要的意义。