目的:水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirdo nipponica Whitman、柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体,具有破血通经,逐瘀消癥的功效,临床主要用于血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫、跌扑损伤等。目前,药材市场上的水蛭来源以蚂蟥为主,水蛭及柳叶蚂蟥十分罕见,充斥着大量混伪品;其次,市场上流通的水蛭多为野生资源,导致药材质量良莠不齐,且部分水蛭药材重金属超出限量范围。水蛭的化学成分主要为蛋白质、多肽、多糖等大分子类化合物及氨基酸等小分子化合物,而《中华人民共和国药典》(2015年版,以下简称《中国药典》)中仅规定了水蛭的性状鉴别、薄层色谱鉴别、抗凝血酶活性定量方法和常规检查项,难以全面评价其药材质量、保证其临床用药的有效性和安全性。考虑到水蛭药材临床用药的广泛性,本研究在现行质量标准的基础上,从药材的鉴别方法、特征及指纹图谱、重金属检查以及蛋白质、氨基酸、多肽、多糖的含量测定多角度建立水蛭药材的质量控制方法,并制定水蛭药材质量标准草案,为其药材质量的控制和质量标准的研究提供一定的参考价值。方法:(1)由于《中国药典》(2015年版)水蛭药材项下规定的薄层色谱方法难以实现所收集药材的真伪鉴别,因此采用试剂盒法提取DNA建立DNA条形码鉴别方法;采用近红外光谱(Near lnfrared Spectros.NIRS)仪建立近红外光谱一致性检验模型。(2)利用垂直平板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)法、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)建立蛋白质电泳特征图谱及游离氨基酸高效液相指纹图谱。(3)按照《中国药典》(2015年版)水蛭药材项下规定的水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸碱度、重金属以及黄曲霉毒素测定方法进行常规检查及有害物质检查,分别测定水蛭药材水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸碱度及铅(Pb)、镉(Cd)、砷(As)、汞(Hg)、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。(4)按照《中国药典》(2015年版)水蛭药材项下规定进行体外抗凝血酶活性的定量研究;采用高效液相色谱仪测定水解及游离氨基酸、半自动定氮仪测定总蛋白质、紫外分光光度计及酶标仪分别测定多糖和多肽的含量。(5)基于体外抗凝血酶活性研究及在体盐酸肾上腺素诱导的斑马鱼血栓模型,初步评价水蛭的多糖及酶解提取物的抗血栓作用。结果:(1)建立了水蛭DNA条形码鉴别方法,基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基 Ⅰ(Mitochondrial cytochrome oxidase I,COI)基因的 18 批水蛭样品条形码长度 617 bp,鸟嘌呤胞嘧啶(Guanine Cytosine,GC)的含量范围为31.60-36.75%。2批菲牛蛭与水蛭药材之间比对,有140个变异位点,8批伪品与水蛭药材之间有195个变异位点,菲牛蛭和市售混伪品在序列长度和含量上与正品水蛭均有差异,邻接系统聚类树表明正品水蛭聚集在一起,菲牛蛭和混伪品分别聚为一类,且支持率达100%;建立的近红外一致性检验模型,设置CI值为6.0时,可完全将所收集药材的正品和混伪品区分开。通过这两种方法可以实现所收集药材的真伪鉴别,且DNA条形码方法可以实现对所收集药材的基原鉴别。(2)建立了 SDS-PAGE蛋白电泳特征图谱以及游离氨基酸HPLC指纹图谱,实现了水蛭药材蛋白质及游离氨基酸的化学定性分析。指纹图谱指认出16个共有峰,相似度评价分析显示,药材间的相似度在0.960以上,且聚类分析与主成分分析的结果一致。(3)水蛭药材的水分、酸碱度、总灰分、酸不溶性灰分以及黄曲霉毒素均符合《中国药典》(2015年版)规定,重金属Pb、Hg全部符合标准,但分别有10批药材Cd、As超出限量标准。(4)分别建立了准确有效的游离及水解氨基酸、总蛋白质、总多糖和酶解物中多肽的含量测定方法,实现了对1 8批水蛭药材的含量测定。18批药材中水解氨基酸含量均值排序为天门冬氨酸>谷氨酸>赖氨酸>亮氨酸>丙氨酸>组氨酸>甘氨酸>缬氨酸>精氨酸>苏氨酸>丝氨酸>脯氨酸>酪氨酸>苯丙氨酸>异亮氨酸>甲硫氨酸;游离氨基酸含量均值排序为谷氨酸>丙氨酸>天门冬氨酸>亮氨酸>甘氨酸>缬氨酸>丝氨酸>脯氨酸>异亮氨酸>苏氨酸>苯丙氨酸>甲硫氨酸>赖氨酸>酪氨酸>精氨酸>组氨酸。所测18批水蛭药材中游离及水解氨基酸含量的均值分别为9.9195±2.1025 mg/g、101.2436±23.2982 mg/g,可考虑将总游离和水解氨基酸含量作为水蛭质量评价指标;18 批水蛭药材的总蛋白含量均值为70.78±1.55%,S7药材含量高达76.34%;18批水蛭药材的多糖含量均值为6.14±1.50 mg/g,S10药材多糖含量高达13.22 mg/g;18批水蛭药材的多肽含量均值为318.06±16.60 mg/g,S8药材多肽含量高达354.54 mg/g。不同批次水蛭药材的总蛋白、多糖及多肽含量均存在明显差异,提示可考虑将总蛋白、多糖及多肽作为水蛭药材质量评价指标。(5)基于体外抗凝血酶活性研究及在体盐酸肾上腺素诱导的斑马鱼血栓模型,水蛭多糖及酶解提取物均具有明显的体外抗凝血酶活性及体内抗血栓活性。当多糖暴露浓度为300 μg/mL时,血栓抑制率高达73.72%,当酶解物暴露浓度为260μg/mL时,血栓抑制率高达78.72%,且血栓抑制率与多糖及酶解物浓度呈依赖性关系,组间差异具有显著统计学意义。结论:中药水蛭具有较强的抗血栓作用,并广泛应用于临床,因此,对水蛭药材进行系统性评价和质量控制尤为重要。本研究从DNA条形码及近红外光谱,从水蛭的基原和真伪鉴别出发,建立了水蛭药材的蛋白质特征图谱及游离氨基酸指纹图谱,进行了水蛭药材的常规及有害物质检查,完成了游离及水解氨基酸、总蛋白质、总多糖、多肽的含量测定,并初步评价了水蛭多糖及酶解物的体内外抗血栓活性,多角度的完善了水蛭药材的质量控制方法,并提出了质量标准草案。水蛭中多糖及酶解物成分具有明显的体内外抗血栓活性,且查阅资料发现多肽为酶解物的主要组成成分,因此,可考虑将多糖和多肽含量作为水蛭药材的质量评价指标。