目的:非甾体类抗炎药(NSAIDs)，是一类具有解热、镇痛、消炎、抗风湿及抗血小板作用的传统药物。近些年来的流行病学调查及临床试验研究证实非甾体类抗炎药能够抑制多种肿瘤细胞的增殖、影响其癌基因的表达与蛋白激酶活性及诱导凋亡等作用。本课题旨在进一步验证NSAIDs中sulindac、aspirin对人肝癌细胞生长增殖的影响以及其诱导细胞凋亡的可能机制。 方法:为观察sulindac、aspirin对肝癌细胞生长增殖及诱导细胞凋亡的影响，以不同浓度的sulindac和aspirin处理细胞后，观察48小时内不同时间细胞形态学的变化，并用MTT法检测肝癌细胞的增殖情况；应用流式细胞仪检测sulindac、aspirin对细胞凋亡的影响；为进一步验证这两种药物能否诱导细胞凋亡，采用hoechst33258染色在荧光显微镜下观察核固缩、核碎裂或凋亡小体等凋亡特征性形态学改变并应用western blot检测细胞凋亡的关键分子caspase-9、caspase-3、PARP等的剪切情况；为探讨sulindac、aspirin影响细胞增殖及诱导凋亡的机制是否与β-连环蛋白的蛋白水平改变以及其上游糖原合酶激酶3β(GSK3β)分子的磷酸化水平有关，利用western blot分别检测其水平；为明确GSK3 β的磷酸化水平变化是否与蛋白激酶β(PKB)的活性有关，进一步检测PKB308位苏氨酸及473位丝氨酸的磷酸化水平；免疫化学染色进一步观察B连环蛋白的细胞浆及核内分布变化；提取核蛋白进一步确证β-连环蛋白在细胞核内的分布水平。 结果:MTT法检测结果表明sulindac(200tlM)对于肝癌细胞生长增殖有显著地抑制作用，同时流式细胞术、荧光染色证实sulindac可以诱导明显地细胞凋亡，表现为细胞形态变圆、皱缩、体积变小，荧光染色可见细胞核固缩、染色质浓集、边集，部分细胞还可见典型的凋亡小体；而aspirin在该处理浓度下(5mM)，普通光镜下形态学没有明显的变化，MTT法、流式细胞术、荧光染色也未见明显的增殖抑制及细胞凋亡。Western blot进一步检测caspase-9、caspase-3、PARP等凋亡关键分子，证实sulindac可以诱导caspase-3通路相关分子发生明显的剪切激活，然而aspirin处理后未见剪切。Sulindac处理24小时后，β-连环蛋白的总蛋白水平明显减少，通过提取细胞核蛋白证实β-连环蛋白在细胞核内的含量也明显减少；western blot检测到β连环蛋白上游的GSK3 β的磷酸化水平也得到了相应的抑制；进一步对PKB活性的检测却显示308位的苏氨酸、473位的丝氨酸磷酸化水平均有所增强。Aspirin处理同样的时间后，β-连环蛋白的核内外蛋白水平没有特别明显变化；GSK3 β磷酸化水平也略有升高，而PKB308位苏氨酸及473位丝氨酸却显著升高，与GSK3β磷酸化水平的变化幅度不一致。 结论:sulindac可以通过抑制GSK3 β的磷酸化，促进细胞内B一连环蛋白的降解，从而减少该蛋白进入细胞核内，进而抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡，并且该诱导凋亡的作用是依赖caspase-3途径；另外，对GSK3 β的磷酸化抑制不依赖于PKB活性的抑制，说明该诱导细胞凋亡的机制独立于PKB途径。经aspirin处理的细胞则可以通过上调PKB的活性对抗细胞凋亡。