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第一部分中期因子调控ACE–血管紧张素Ⅱ介导肺血管内皮细胞损伤的作用及机制研究
目的：明确中期因子调控ACE–AngⅡ介导肺血管内皮细胞损伤的作用及机制。
方法：使用中期因子刺激小鼠肺血管内皮细胞，Notch2抑制剂DAPT阻断Notch2受体活性，分别检测对照组、中期因子刺激组以及中期因子刺激及Notch2抑制组各组细胞的下列指标：(1)蛋白质印迹检测血管内皮细胞ACE表达，FAPGG实验检测ACE的活性，以及加入AngI后ACE水解产生的AngII浓度；(2)DCFH-DA法检测加入AngI后肺血管内皮细胞产生氧自由基(ROS)的变化，CCK-8检测肺血管内皮细胞活性变化情况；(3)免疫荧光检测细胞间连接蛋白VE-Cadherin及ZO-1的表达，蛋白质印迹检测VE-Cadherin蛋白表达，明确肺血管内皮细胞通透性改变情况；(4)免疫荧光和蛋白质印迹检测细胞炎性黏附分子VCAM-1的蛋白表达，明确肺血管内皮细胞炎症反应变化情况。
结果：(1)使用中期因子刺激肺微血管内皮细胞后其ACE的mRNA和蛋白的表达水平升高，ACE的活性增强，加入AngⅠ后ACE水解产生的AngⅡ水平明显升高(P＜0.05)；(2)使用DAPT抑制Notch2受体活性后，ACE水解活性和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)，ACE水解AngⅠ产生的AngⅡ水平明显降低(P＜0.05)；(3)使用中期因子刺激肺血管内皮细胞并加入AngI后，细胞ROS活性明显升高，细胞活力降低(P＜0.05)，阻断Notch2受体能够明显降低肺血管内皮细胞ROS活性，改善细胞活力；(4)免疫荧光提示使用中期因子刺激肺血管内皮细胞并加入AngI后，细胞间连接蛋白VE-Cadherin及ZO-1的表达水平明显降低，蛋白质印迹进一步表明VE-Cadherin蛋白表达水平降低，阻断Notch2受体能够明显恢复细胞间连接蛋白的表达水平，改善血管内皮细胞通透性；(5)免疫荧光和蛋白质印迹结果显示，使用中期因子刺激肺血管内皮细胞并加入AngⅠ后，细胞表面表达的炎性黏附分子VCAM-1蛋白水平升高，阻断Notch2受体能够明显降低肺血管内皮细胞VCAM-1的表达水平，改善细胞的炎症反应。
结论：中期因子通过Notch2受体调控ACE–AngⅡ介导肺血管内皮细胞损伤。
第二部分中期因子调控ACE–血管紧张素II介导脓毒症诱导肺损伤的作用及机制研究
目的：明确中期因子调控ACE–AngⅡ介导脓毒症小鼠肺损伤的作用与机制。
方法：构建干扰中期因子表达的腺相关病毒(AAV)，通过气道注射的方式感染小鼠肺组织并检测其感染及干扰效率；通过盲肠结扎穿孔(CLP)建立脓毒症小鼠模型，模型建立24小时后，检测CLP组、AAV干预的CLP组及假手术组小鼠的下列指标：(1)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠外周血浆中期因子、ACE及AngⅡ的水平；通过蛋白质印迹及免疫组化检测各组小鼠肺组织中期因子的蛋白表达，通过蛋白质印迹检测各组小鼠肺组织中ACE的蛋白表达；(2)H&E染色切片及病理评分检测小鼠肺组织病理损伤；(3)细胞计数检测小鼠BALF中炎性细胞浸润，通过ELISA检测BALF中炎性因子TNF-α的水平；通过MPO活性检测小鼠肺组织中性粒细胞浸润，从而明确小鼠肺部炎症反应；(4)通过BCA法检测小鼠BALF中蛋白水平，检测小鼠肺湿/干比重明确小鼠肺水肿及肺血管通透性；(4)蛋白质印迹检测小鼠肺组织ACE蛋白表达水平；通过FAPGG检测ACE的水解活性；在肺组织蛋白匀浆中加入AngⅠ，通过ELISA检测AngⅡ水平。
结果：(1)组织免疫荧光结果表明，气道注射干扰中期因子表达的AAV能够有效感染小鼠肺组织，并且能够有效干扰小鼠肺组织中期因子蛋白表达水平(干扰效率大于70%)；(2)CLP组较之假手术组小鼠外周血中期因子水平明显升高[ng/L,747.3(703.6-811.1)vs.87(64.5-199.5),P=0.0095]；肺组织中期因子蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)；经气道注射AAV能够有效干扰CLP组小鼠肺组织中期因子蛋白表达水平；(3)CLP模型能够诱导小鼠肺组织病理损伤，干扰小鼠肺组织中期因子蛋白表达能够有效改善CLP小鼠肺组织病理损伤，降低病理损伤评分(11.3±1.6vs.7.0±1.1,P=0.038)；(4)CLP模型小鼠BALF中炎性细胞数量及TNF-α水平较之假手术组明显升高，肺组织MPO活性明显增强，干预小鼠肺组织中期因子蛋白表达能够有效降低CLP小鼠BALF中的炎性细胞数量(P＜0.05)及TNF-α水平(P＜0.05)，降低肺组织MPO活性(P＜0.05)，改善CLP模型小鼠肺组织炎症反应；(5)CLP模型小鼠BALF蛋白水平及肺湿/干重比较之假手术组明显升高，干预小鼠肺组织中期因子蛋白表达能够有效降低CLP小鼠BALF中蛋白水平
(P＜0.05)及肺湿/干重比(P＜0.05)，改善CLP模型小鼠肺水肿；(6)CLP模型小鼠肺组织中ACE蛋白表达水平明显增加，ACE的水解活性增强，加入AngⅠ水解产生的AngⅡ水平升高，而干扰小鼠肺组织中期因子蛋白表达后能够降低ACE的蛋白表达水平及水解活性，加入AngⅠ后所产生的AngⅡ水平明显降低(P＜0.05)。
结论：中期因子通过ACE-AngⅡ介导脓毒症诱导的急性肺损伤。
第三部分中期因子–ACE–血管紧张素Ⅱ与脓毒症患者病情严重程度和预后的相关性研究
目的：探讨血浆中期因子–ACE–AngII与脓毒症患者病情严重程度与预后之间的关系。方法：纳入从2018年11月至2019年03月收治入住东南大学附属中大医院重症医学科，并且符合sepsis-3诊断标准的脓毒症患者。(1)记录患者入科时的一般情况，包括患者性别、年龄、既往慢性疾病病史等；(2)记录患者此次入院的疾病相关情况，包括入科诊断、感染部位、序贯器官功能衰竭评分(SOFA)、是否存在休克、是否合并急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及急性肾损伤(AKI)等；(3)记录患者的相关治疗措施，包括血管活性药物的使用、机械通气及持续肾替代治疗(CRRT)等；(4)记录患者入科当天实验室检查结果，包括血细胞分析、生化常规及血气分析等；(5)对于行持续有创血流动力学监测(PiCCO)的患者，记录血管外肺水指数(EVLWI)、肺血管通透性指数(PVPI)及全身血管阻力指数(SVRI)等指标；(6)所有患者随访至第28天并记录患者生存或死亡情况并记录死亡时间；(7)留取患者入科时外周血，分离血浆，通过酶联免疫试验检测脓毒症患者外周血浆中期因子、ACE及AngⅡ的水平。
结果：研究期间共纳入26名符合条件的脓毒症患者。结果提示：(1)纳入患者的平均年龄为63.1±19岁，男性患者21名(80.9%)，肺部为常见的感染部位(15人，57%)，随访患者至28天的病死率为28.6%；(2)死亡组患者SOFA评分明显高于存活组患者(11.9±3.2vs.7.2±3.1,P=0.002)，患者行CRRT治疗的比率更高(6/8vs.1/18,P=0.001)，无机械通气时间[天,0(0-5)vs.10(5-15.3),P=0.001]和无CRRT时间[天,0(0-2.5)vs.7.5(4.8-18.3),P=0.002]更短；纳入的26名患者中22名患者合并ARDS(8人轻度、8人中度及6人重度)，13名患者合并AKI；(3)血浆中期因子水平和脓毒症患者预后相关。脓毒症患者死亡组较生存组血浆中期因子水平明显升高[ng/L,763.6(404.7-1305)vs.268.5(147.8-511.4),P=0.0387]；中期因子预测脓毒症患者28天死亡的AuROC为0.773(95%CI0.549-0.997,P=0.039)；通过约登指数计算最佳阈值点为760ng/L，敏感度为0.57，特异性为0.94；据此分组的两组患者间28天死亡率具有明显差异(Log-rankP=0.0024)，
风险比(HR)为6.16(95% CI 0.83-45.52)；(4)血浆中期因子水平和脓毒症患者病情严重程度相关。合并中/重度ARDS患者血浆中期因子水平较之无/轻度ARDS患者组明显升高[ng/L,522.3(336.6-960.1)vs.243.8(110.3-478.9),P=0.0135]；合并AKI的脓毒症患者血浆中期因子水平更高[ng/L,489.8(259.2-1058)vs.427.9(129.6-510.3),P=0.0973]；(5)11名患者行PiCCO监测，血浆中期因子的水平和PVPI线性相关(P=0.049)，与EVLWI(P=0.063)有线性相关趋势，但和SVRI(P=0.299)并无相关性；(6)脓毒症患者血浆中期因子与ACE(P=0.0676)和AngⅡ(P=0.070)具有线性相关趋势。
结论：脓毒症患者血浆中期因子水平和患者28天病死率和病情严重程度相关
目的：明确中期因子调控ACE–AngⅡ介导肺血管内皮细胞损伤的作用及机制。
方法：使用中期因子刺激小鼠肺血管内皮细胞，Notch2抑制剂DAPT阻断Notch2受体活性，分别检测对照组、中期因子刺激组以及中期因子刺激及Notch2抑制组各组细胞的下列指标：(1)蛋白质印迹检测血管内皮细胞ACE表达，FAPGG实验检测ACE的活性，以及加入AngI后ACE水解产生的AngII浓度；(2)DCFH-DA法检测加入AngI后肺血管内皮细胞产生氧自由基(ROS)的变化，CCK-8检测肺血管内皮细胞活性变化情况；(3)免疫荧光检测细胞间连接蛋白VE-Cadherin及ZO-1的表达，蛋白质印迹检测VE-Cadherin蛋白表达，明确肺血管内皮细胞通透性改变情况；(4)免疫荧光和蛋白质印迹检测细胞炎性黏附分子VCAM-1的蛋白表达，明确肺血管内皮细胞炎症反应变化情况。
结果：(1)使用中期因子刺激肺微血管内皮细胞后其ACE的mRNA和蛋白的表达水平升高，ACE的活性增强，加入AngⅠ后ACE水解产生的AngⅡ水平明显升高(P＜0.05)；(2)使用DAPT抑制Notch2受体活性后，ACE水解活性和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)，ACE水解AngⅠ产生的AngⅡ水平明显降低(P＜0.05)；(3)使用中期因子刺激肺血管内皮细胞并加入AngI后，细胞ROS活性明显升高，细胞活力降低(P＜0.05)，阻断Notch2受体能够明显降低肺血管内皮细胞ROS活性，改善细胞活力；(4)免疫荧光提示使用中期因子刺激肺血管内皮细胞并加入AngI后，细胞间连接蛋白VE-Cadherin及ZO-1的表达水平明显降低，蛋白质印迹进一步表明VE-Cadherin蛋白表达水平降低，阻断Notch2受体能够明显恢复细胞间连接蛋白的表达水平，改善血管内皮细胞通透性；(5)免疫荧光和蛋白质印迹结果显示，使用中期因子刺激肺血管内皮细胞并加入AngⅠ后，细胞表面表达的炎性黏附分子VCAM-1蛋白水平升高，阻断Notch2受体能够明显降低肺血管内皮细胞VCAM-1的表达水平，改善细胞的炎症反应。
结论：中期因子通过Notch2受体调控ACE–AngⅡ介导肺血管内皮细胞损伤。
第二部分中期因子调控ACE–血管紧张素II介导脓毒症诱导肺损伤的作用及机制研究
目的：明确中期因子调控ACE–AngⅡ介导脓毒症小鼠肺损伤的作用与机制。
方法：构建干扰中期因子表达的腺相关病毒(AAV)，通过气道注射的方式感染小鼠肺组织并检测其感染及干扰效率；通过盲肠结扎穿孔(CLP)建立脓毒症小鼠模型，模型建立24小时后，检测CLP组、AAV干预的CLP组及假手术组小鼠的下列指标：(1)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠外周血浆中期因子、ACE及AngⅡ的水平；通过蛋白质印迹及免疫组化检测各组小鼠肺组织中期因子的蛋白表达，通过蛋白质印迹检测各组小鼠肺组织中ACE的蛋白表达；(2)H&E染色切片及病理评分检测小鼠肺组织病理损伤；(3)细胞计数检测小鼠BALF中炎性细胞浸润，通过ELISA检测BALF中炎性因子TNF-α的水平；通过MPO活性检测小鼠肺组织中性粒细胞浸润，从而明确小鼠肺部炎症反应；(4)通过BCA法检测小鼠BALF中蛋白水平，检测小鼠肺湿/干比重明确小鼠肺水肿及肺血管通透性；(4)蛋白质印迹检测小鼠肺组织ACE蛋白表达水平；通过FAPGG检测ACE的水解活性；在肺组织蛋白匀浆中加入AngⅠ，通过ELISA检测AngⅡ水平。
结果：(1)组织免疫荧光结果表明，气道注射干扰中期因子表达的AAV能够有效感染小鼠肺组织，并且能够有效干扰小鼠肺组织中期因子蛋白表达水平(干扰效率大于70%)；(2)CLP组较之假手术组小鼠外周血中期因子水平明显升高[ng/L,747.3(703.6-811.1)vs.87(64.5-199.5),P=0.0095]；肺组织中期因子蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)；经气道注射AAV能够有效干扰CLP组小鼠肺组织中期因子蛋白表达水平；(3)CLP模型能够诱导小鼠肺组织病理损伤，干扰小鼠肺组织中期因子蛋白表达能够有效改善CLP小鼠肺组织病理损伤，降低病理损伤评分(11.3±1.6vs.7.0±1.1,P=0.038)；(4)CLP模型小鼠BALF中炎性细胞数量及TNF-α水平较之假手术组明显升高，肺组织MPO活性明显增强，干预小鼠肺组织中期因子蛋白表达能够有效降低CLP小鼠BALF中的炎性细胞数量(P＜0.05)及TNF-α水平(P＜0.05)，降低肺组织MPO活性(P＜0.05)，改善CLP模型小鼠肺组织炎症反应；(5)CLP模型小鼠BALF蛋白水平及肺湿/干重比较之假手术组明显升高，干预小鼠肺组织中期因子蛋白表达能够有效降低CLP小鼠BALF中蛋白水平
(P＜0.05)及肺湿/干重比(P＜0.05)，改善CLP模型小鼠肺水肿；(6)CLP模型小鼠肺组织中ACE蛋白表达水平明显增加，ACE的水解活性增强，加入AngⅠ水解产生的AngⅡ水平升高，而干扰小鼠肺组织中期因子蛋白表达后能够降低ACE的蛋白表达水平及水解活性，加入AngⅠ后所产生的AngⅡ水平明显降低(P＜0.05)。
结论：中期因子通过ACE-AngⅡ介导脓毒症诱导的急性肺损伤。
第三部分中期因子–ACE–血管紧张素Ⅱ与脓毒症患者病情严重程度和预后的相关性研究
目的：探讨血浆中期因子–ACE–AngII与脓毒症患者病情严重程度与预后之间的关系。方法：纳入从2018年11月至2019年03月收治入住东南大学附属中大医院重症医学科，并且符合sepsis-3诊断标准的脓毒症患者。(1)记录患者入科时的一般情况，包括患者性别、年龄、既往慢性疾病病史等；(2)记录患者此次入院的疾病相关情况，包括入科诊断、感染部位、序贯器官功能衰竭评分(SOFA)、是否存在休克、是否合并急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及急性肾损伤(AKI)等；(3)记录患者的相关治疗措施，包括血管活性药物的使用、机械通气及持续肾替代治疗(CRRT)等；(4)记录患者入科当天实验室检查结果，包括血细胞分析、生化常规及血气分析等；(5)对于行持续有创血流动力学监测(PiCCO)的患者，记录血管外肺水指数(EVLWI)、肺血管通透性指数(PVPI)及全身血管阻力指数(SVRI)等指标；(6)所有患者随访至第28天并记录患者生存或死亡情况并记录死亡时间；(7)留取患者入科时外周血，分离血浆，通过酶联免疫试验检测脓毒症患者外周血浆中期因子、ACE及AngⅡ的水平。
结果：研究期间共纳入26名符合条件的脓毒症患者。结果提示：(1)纳入患者的平均年龄为63.1±19岁，男性患者21名(80.9%)，肺部为常见的感染部位(15人，57%)，随访患者至28天的病死率为28.6%；(2)死亡组患者SOFA评分明显高于存活组患者(11.9±3.2vs.7.2±3.1,P=0.002)，患者行CRRT治疗的比率更高(6/8vs.1/18,P=0.001)，无机械通气时间[天,0(0-5)vs.10(5-15.3),P=0.001]和无CRRT时间[天,0(0-2.5)vs.7.5(4.8-18.3),P=0.002]更短；纳入的26名患者中22名患者合并ARDS(8人轻度、8人中度及6人重度)，13名患者合并AKI；(3)血浆中期因子水平和脓毒症患者预后相关。脓毒症患者死亡组较生存组血浆中期因子水平明显升高[ng/L,763.6(404.7-1305)vs.268.5(147.8-511.4),P=0.0387]；中期因子预测脓毒症患者28天死亡的AuROC为0.773(95%CI0.549-0.997,P=0.039)；通过约登指数计算最佳阈值点为760ng/L，敏感度为0.57，特异性为0.94；据此分组的两组患者间28天死亡率具有明显差异(Log-rankP=0.0024)，
风险比(HR)为6.16(95% CI 0.83-45.52)；(4)血浆中期因子水平和脓毒症患者病情严重程度相关。合并中/重度ARDS患者血浆中期因子水平较之无/轻度ARDS患者组明显升高[ng/L,522.3(336.6-960.1)vs.243.8(110.3-478.9),P=0.0135]；合并AKI的脓毒症患者血浆中期因子水平更高[ng/L,489.8(259.2-1058)vs.427.9(129.6-510.3),P=0.0973]；(5)11名患者行PiCCO监测，血浆中期因子的水平和PVPI线性相关(P=0.049)，与EVLWI(P=0.063)有线性相关趋势，但和SVRI(P=0.299)并无相关性；(6)脓毒症患者血浆中期因子与ACE(P=0.0676)和AngⅡ(P=0.070)具有线性相关趋势。
结论：脓毒症患者血浆中期因子水平和患者28天病死率和病情严重程度相关