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在本实验室之前的研究中,利用毕赤酵母对人白介素-2(IL-2)和人血清白蛋白(HSA)融合蛋白进行表达,分别将IL-2连在HSA的N-端(IL-2-HSA)和C-端(HSA-IL-2)得到的融合蛋白都具有良好的生物学活性,其半衰期也由IL-2单体的6.9 min延长至13.24 h。但在研究中发现,毕赤酵母在表达HSA融合蛋白时存在蛋白降解、产物不均一和过度糖基化等现象,导致分离纯化困难,活性下降以及半衰期缩短等问题,这些不利因素限制了毕赤酵母在表达IL-2融合蛋白中的应用。目前中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)已成功应用于多种药物蛋白的表达,因此本研究将IL-2和HSA的融合蛋白在CHO细胞中进行表达,对筛选得到的工程细胞株的生长状态和蛋白表达进行了检测,同时对融合蛋白的分离纯化策略和生物活性进行了分析。本研究利用基因工程技术构建两种不同连接方式的融合蛋白表达质粒,并通过电转染的方法分别转入CHO细胞中,经过四次克隆筛选和摇瓶终筛获得了高效表达HSA-IL-2融合蛋白的细胞株CHO/p MH3-HSA-IL-2/9和表达IL-2-HSA融合蛋白的细胞株CHO/p MH3-IL-2-HSA/8。进行Western blot检测后发现两种融合蛋白都具有HSA和IL-2双重免疫原性,CTLL-2/MTT法检测发现,筛选得到的细胞株分泌表达的融合蛋白都具有一定的生物活性。对筛选得到的细胞株进行3 L摇瓶流加培养,CHO/p MH3-HSA-IL-2/9和CHO/p MH3-IL-2-HSA/8在流加培养期间细胞密度最高分别达到6.4×106 cells·m L-1和6.7×106 cells·m L-1,七天积累表达量分别为138 mg·L-1和118 mg·L-1,SDS-PAGE和Western blot检测未发现明显的降解条带。对表达产物进行分离纯化,初步确定了融合蛋白的分离纯化步骤:发酵液经离心、微滤后,再依次经过Blue Sepharose、Phenyl Sepharose和Q Sepharose层析,获得的融合蛋白HSA-IL-2和IL-2-HSA纯度分别为96.5%和95.3%,纯化回收率分别为17.29%和14.77%。CTLL-2/MTT法检测融合蛋白生物活性,HSA-IL-2的比活性约为1.03×107 IU·mg-1,IL-2-HSA约为8.3×106 IU·mg-1,与毕赤酵母表达IL-2-HSA融合蛋白的生物活性水平基本相当。