目的:脓毒血症及其引发的脓毒症休克和多器官衰竭是临床医生和研究者共同关注的问题,目前普遍认为脓毒血症病理机理的根本原因是机体炎症反应和抗炎反应失衡。腺苷A2A受体可介导抑制免疫反应的信号,减轻组织损伤,已有研究报道,腺苷A2A受体拮抗剂能有效提高脓毒血症小鼠生存率。在炎症的发生发展过程中,内皮细胞和炎症细胞都参与疾病过程,A2A受体拮抗剂对脓毒血症的调节作用是否与内皮细胞的功能有关还未见报道。因此,本课题将利用内皮细胞腺苷A2A受体特异性敲除小鼠,采用盲肠结扎穿孔手术(CecalLigation and Puncture,CLP)建立小鼠脓毒血症模型,并与A2A受体拮抗剂的治疗作用进行比较,探讨A2A受体拮抗剂对脓毒血症的调控作用与内皮细胞功能的相关性。方法:1.小鼠脓毒血症模型建立。选取9~12W的C57BL/6J雄性小鼠,通过结扎盲肠50%和75%后穿孔手术,建立脓毒血症模型。模型建立后,统计小鼠生存率;细菌培养检测血液和腹腔液载菌量的变化;血常规仪检测白细胞数、中性粒细胞数、单核细胞、淋巴细胞、血小板数目变化;血生化仪检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清尿素氮(BUN)水平;Luminex仪检测细胞因子GM-CSF、INF-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2表达;ELISA检测内皮功能紊乱分子血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)、E-选择素(E-selection)、血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)、可溶性细胞黏附因子-1(sICAM-1)、内皮细胞生长因子(vegf)及其受体vegfr-1;he染色检测clp术后小鼠肺、肝、肾组织血栓形成及其它病理变化。2.腺苷a2a受体拮抗对脓毒血症的治疗作用。根据c57bl/6j野生型小鼠术后变化指标,利用内皮细胞上腺苷a2a受体特异性敲除小鼠(a2afloxp/floxpcdh5cre/+)和背景对照小鼠(a2afloxp/floxp)进行clp实验,同时对a2afloxp/floxp小鼠术后给予腺苷a2a受体抑制剂kw6002(10mg/kg,s.c.)和溶剂,进行a2a受体拮抗剂对小鼠脓毒血症治疗机制的研究。术后统计小鼠生存率;检测血液和腹腔液16h和48h载菌量变化;血常规和血液生化指标;细胞因子il-1α、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-10、il-12、il-15、il-17和趋化因子mip-1α、mip-1β、mip-2水平;内皮功能紊乱标志物tm、e-selection、vcam-1、sicam-1、vegf、vegfr-1的变化;肺、肝、肾组织病理检测血栓形成等病理变化;综合以上数据评价腺苷a2a受体抑制对脓毒血症的治疗作用与小鼠内皮细胞腺苷a2a受体敲除的相关性。结果:1.c57bl/6j小鼠脓毒血症模型建立小鼠进行clp手术,其生存率与盲肠结扎位点相关,结扎小鼠盲肠75%术后4天小鼠全部死亡,结扎小鼠盲肠50%术后12天生存率约为40%;采用50%结扎手术,与假手术组比,临床血液指标检测显示,术后16h和48h与假手术组相比白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞明显下降;血生化指标显示谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast),血清尿素氮(bun)明显升高;细胞因子检测结果显示,促炎因子il-1α、il-6、tnf-α和抗炎因子il-10以及趋化因子mip-1α、mip-1β、mip-2明显上升,其它因子未见明显变化;内皮功能紊乱标志物检测显示sicam-1、e-slectin、vegf、vegfr1和tm呈上升趋势,vcam-1未见明显变化。组织病理检测可见clp术后小鼠肺组织间质充血,有弥散性血管内凝血(dic)和血栓形成,肝脏和肾脏也出现充血和血栓,但没有肺脏病变明显。2.腺苷a2a受体拮抗对脓毒血症治疗作用a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠是血管内皮腺苷受体条件性敲除小鼠,在生理正常条件下不影响渗透功能,在clp疾病状况下,给予evansblue显示肝、肾、肺组织的渗透下降。利用a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠进行clp实验,同时对a2afloxp/floxp小鼠术后皮下给予腺苷受体抑制剂kw6002(10mg/kg)和溶剂。结果显示:(1)小鼠死亡率:a2afloxp/floxp小鼠12天死亡率95%,a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠12天死亡率55%,血管内皮腺苷受体a2a敲除小鼠进行clp实验明显比对照小鼠的死亡率降低。a2afloxp/floxp小鼠溶剂组小鼠死亡率85%,给抑制剂组为38%,a2a抑制剂给予clp术后小鼠与对照组相比,明显降低死亡率。(2)血液中载菌量检测:a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠术后16h,比a2afloxp/floxp小鼠明显下降,术后48h也显示相似的下降趋势;a2afloxp/floxp小鼠术后给予抑制剂组术后16h的载菌量比溶剂组显示下降趋势,术后48h也显示相似的下降趋势。腹腔载菌量检测,a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠术后16h,比a2afloxp/floxp小鼠明显下降,术后48h也显示相似的下降趋势;a2afloxp/floxp小鼠术后给予抑制剂组术后16h的载菌量比溶剂组显示下降趋势,术后48h也显示相似的下降趋势。(3)血常规检测:a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比较,术后16h、48h白细胞数未见明显变化;白细胞分类中中性粒细胞数在术后16h出现下降趋势,其它单核细胞数和淋巴细胞数上都未见明显变化。a2afloxp/floxp小鼠术后给予抑制剂组与溶剂组比较,术后16h、48h白细胞数未见明显变化;白细胞分类中中性粒细胞数在术后16h出现下降趋势,单核细胞数和淋巴细胞数上都未见明显变化。(4)血生化指标检测:a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比较,术后16h,48h肝转氨酶ast和尿素氮bun出现下降趋势,谷丙转氨酶alt未见明显变化趋势,但是a2afloxp/floxp小鼠术后给予抑制剂与溶剂比较,术后16h,48halt,ast,bun未见明显变化趋势。(5)细胞因子检测:a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比较,术后16h,炎症因子il1α、il10、il6、mip1β、mip2明显下降,其它因子mip1α、tnfα水平无明显变化;术后48h检测的炎症因子,未见明显变化。a2afloxp/floxp小鼠术后给予抑制剂组与溶剂组比较,术后16h,il1α、il10、il6、mip1β、mip2明显下降,其它因子mip1α、tnfα水平无明显变化;术后48h检测的炎症因子,未见明显变化。(6)内皮功能相关标志物检测:a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比较,术后16h,tm、tf呈下降趋势,vegf未见明显变化;术后48h,tm维持下降趋势,vegf出现下降趋势,tf未见明显变化。a2afloxp/floxp小鼠术后给予抑制剂组与溶剂组比较,术后16h,tm、tf、vegf出现明显的下降趋势,术后48h,tm维持下降趋势,TF、VEGF未见明显变化。(7)组织病理检测:术后16hA2Afloxp/floxp小鼠肺脏充血,有较大血栓形成在血管内,A2Afloxp/floxp cdh5cre/+小鼠肺组织间隔可见血栓形成,抑制剂组较溶剂组充血和血栓情况减轻。48h各组小鼠肺组织血管内和肺间隔均可见较为严重的血栓形成;肝组织16h病理检测可见,A2Afloxp/floxp小鼠和A2Afloxp/floxp cdh5cre/+小鼠以及溶剂组和伊曲茶碱组肝脏血管内均偶尔可见充血和血栓形成。肾组织病理检测各组小鼠基本正常,A2Afloxp/floxp组和溶剂组小鼠出现肾组织内充血及血栓形成,A2Afloxp/floxp cdh5cre/+小鼠以及伊曲茶碱组肾脏较少充血和血栓形成。结论:1.C57野生型小鼠CLP手术后形成脓毒血症特征,血液出现大量细菌,损伤肝、肾功能,IL-6等促炎因子和趋化因子升高,内皮功能相关标志物TM、VEGF发生变化。2.腺苷A2A受体抑制剂能改善小鼠脓毒血症的生存,降低血液中细菌量,抑制IL6、IL1α、IL10、MIP1α、MIP1β、MIP2升高,降低VEGF、TM和E-slectin和TF水平。3.血管内皮腺苷A2A受体敲除小鼠进行CLP实验,也能改善小鼠脓毒血症的生存,降低血液细菌载量,保护肝肾功能,抑制IL6、MIP2的升高,降低TM、E-slectin、VEGFR1和TF水平。4.腺苷A2A受体抑制剂对小鼠脓毒血症有治疗作用,这种治疗作用与内皮的腺苷受体抑制具有紧密的相关性。