研究背景与目的中国是全球30个结核病高负担国家之一,据WHO最新报告结果显示结核病估算新发病人数为88.9万,发病人数位于高负担国家的第二位。2017年,全球有近60万利福平耐药/耐多药患者(RR/MDR-TB),其中MDR-TB 45.7万例,MDR-TB已成为控制结核病流行的主要难点之一。根据WHO公布数据2017年中国估算新发MDR/RR-TB患者7.3万人,仅次于印度,位居全球第二,约占到全球估算总数的13.1%。但是我国的RR/MDR-TB患者登记数只有近1万人,仅占估算数的17%,在金砖五国中排末位,中国极低的MDR-TB发现率已成为MDR-TB疫情居高不下的关键因素。传统药敏耗时较长,灵敏度和时效性较差,严重影响了 MDR-TB的早期发现。为了提高耐药诊断速度,世界卫生组织2007-2015年陆续推荐了多种基因检测技术。基因芯片技术是基于多重PCR并结合反向杂交的耐多药基因检测试剂盒,该技术能根据检测位点的突变情况快速检测出利福平与异烟肼耐药结果,并判断结核分枝杆菌耐多药情况,既往研究显示该方法的灵敏度和特异度都很高。根据国家结核病“十三五”规划要求,全国将逐步推广MDR-TB快速诊断技术,2017年以来江苏省全面实施结核病分级诊疗综合防治服务模式,积极推广结核病新诊断技术,但是目前应用大样本痰标本直接评估基因芯片技术有效性和适用性的研究还很少。本研究收集大样本的涂片阳性患者的标本,以传统药物敏感结果为金标准,评估基因芯片技术在地市级结核病定点医院开展的效价性。2017年全球MDR/RR-TB患者平均治疗成功率为55%,而我国MDR/RR-TB患者治疗成功率仅为41%,在30个结核病高负担国家中居末位。MDR-TB患者极易在治疗中发生获得性耐药,引发对于喹诺酮类以及二线注射剂药物的进一步耐药,而标准耐多药治疗方案中又包含喹诺酮类药物与二线注射剂。全球9.7%的MDR-TB会进一步发展成为Pre-XDR-TB或XDR-TB。对于这些MDR-TB患者,临床医生一方面要监测与预防患者对其他药物发生耐药,另一方面,对于在治疗中获得性耐药的患者需要做到及时发现、变更治疗方案。国外研究发现耐药基因突变不仅可引发不同的耐药水平,甚至可以将耐药基因突变作为预测MDR-TB患者治疗结局的标志物。目前江苏省还未见报道过抗结核药物的耐药基因突变与MDR-TB患者治疗结局的关联研究。探寻分子层面的耐药基因突变对于治疗结局的影响将对于协助临床做出合理治疗决策有重要意义。研究方法研究对象为2014年1月至2016年7月在江苏省连云港市第四人民医院连续纳入的痰涂片阳性的结核病患者,对其开展利福平、异烟肼的固体培养与传统比例法药物敏感性试验,同时直接应用痰标本开展基因芯片检测,检测位点包括利福平耐药基因rpoB531、526、516、533、511、513的六个位点,异烟肼的耐药基位点katG315与InhA-15。以传统药敏试验结果为金标准,计算基因芯片在检测利福平、异烟肼方面的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值以及一致率。2013-2014年在江苏省的连云港市、镇江市、南通市、泰州市、常州市连续纳入具有完整治疗记录的MDR-TB患者,并随访调查获取MDR-TB患者治疗结局的资料(见附录)。对耐多药患者进行利福平、异烟肼、氧氟沙星和卡那霉素的传统药敏试验。在开始标准耐多药方案治疗前,提取MDR-TB患者核酸并进行DNA测序,测序的耐药基因主要包括一线抗结核药物利福平的耐药基因rpoB相关突变位点、异烟肼的耐药基因katG和InhA启动子区域、吡嗪酰胺的耐药基因pncA、rpsA、二线抗结核药物喹诺酮类药物耐药基因gyrA和gyrB、以及二线注射剂药物耐药基因rrs基因和eis启动子区域。应用DNA测序比对软件ApE将测序结果与标准菌株H37RV的碱基序列比对,在EXCEL中整理各耐药基因在相关位点的突变频率与突变类型。最后将所有数据导入spss25.0中,应用卡方检验、多因素logistics回归分析方法探索耐多药结核病患者治疗结局的影响因素。研究结果在同时开展传统药敏试验与基因芯片检测的1297涂片阳性患者中,最终共有1100例纳入最终的基因芯片诊断价值的研究中。以传统药敏为金标准,基因芯片技术诊断利福平耐药的灵敏度与特异度分别为84.48%,98.18%,一致率为97.45%,阳性预测值与阴性预测值分别为72.06%,99.13%;基因芯片技术诊断异烟肼耐药性的灵敏度与特异度分别为81.91%,97.42%,一致率为96.09%,阳性预测值与阴性预测值分别为74.76%,98.29%。基因芯片技术诊断MDR-TB的灵敏度为80.56%,特异度为99.15%,一致率为98.55%,阳性预测值与阴性预测值分别为76.32%,99.34%。利福平耐药相关rpoB基因526、531、526、516、533、511、513位点上共检测突变68例,其中在rpoB531位点突变频率最高为36.76%、526位点上耐药突变率达到19.12%。异烟肼耐药相关katG基因315位点与InhA-15位点上共检测到突变103例,katG315位点突变达60.19%,InhA-15突变率分别达33.01%。基因芯片共检出38例耐多药患者,其中17例(44.74%)出现了 rpoB531位点突变、8例(21.05%)出现了 rpoB526位点突变,28例(73.68%)出现了 katG315位点突变、9例(23.68%)出现了 InhA-15位点突变。2013-2014年在江苏省五个地级市的结核病定点医院共纳入的87例的耐多药患者,71例MDR-TB患者有相关治疗结局信息。通过对71例MDR-TB患者菌株进行测序发现突变率最高的是rpoB基因,在71例MDR-TB中突变率为93%;其他耐药基因突变率由高到低依次是katG基因(77.5%,55/71)、pncA基因(33.8%,24/71)、gyrA 基因(32.4%,23/71)、eis 基因(15.5%,11/71)、rrs 基因(12.7%,9/71)、gyrB 基因(12.7%,9/71)、InhA(11.3%,8/71)、rpsA 基因(4.2%,3/71)。单因素logistic回归分析结果显示,复治患者(P=0.04,OR=2.79,95%CI:1.046-7.466)、非规范治疗(P=0.01,OR=4.72,95%CI:1.547-14,171)、PZA 基因型耐药(P<0.01,OR=4.16,95%CI:1.485-11.635)、pncA 基因突变(P<0.01,OR=5.29,95%CI:1.764-15.888)以及 gyrA 基因突变(P=0.02,OR=3.75,95%CI:1.245-11.299)是不良治疗结局的危险因素。多因素logistic分析结果显示年龄大于54岁(P=0.04,OR=6.11,95%CI:1.080-34.533)、非规范治疗(P<0.01,OR=7.47,95%CI:1.896-29.436)以及 pncA 基因突变(P=0.01,OR=7.68,95%CI:1.879-31.400)是 MDR-TB 患者不良治疗结局的危险因素。研究结论基因芯片技术直接检测痰标本的利福平与异烟肼的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标值均较高。基因芯片技术对MDR-TB诊断价值较高,可在结核病医院广泛推广应用。吡嗪酰胺的耐药基因pncA基因突变、未规范治疗、年龄大于54岁等因素是MDR-TB患者不良治疗结局间存在较强的关联性,复治患者以及喹诺酮的耐药基因gyrA可能是导致不良治疗结局的危险因子。