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肠炎沙门菌是引起非伤寒沙门菌感染的重要病原体之一,该菌可长期定植于成年家禽肠道和生殖道,呈现隐性感染,并长时间排毒,给养殖业带来巨大经济损失。人类感染沙门菌后可引发胃肠炎,严重者造成死亡。作为人畜共患病原菌,肠炎沙门菌致病机理逐渐引起人们的关注。细菌非编码小RNA是一类长度较短,位于基因间区,不编码蛋白,具有多种调节功能的RNA分子。RyhB作为一种全局性调节RNA,可调控沙门菌铁代谢、硝酸盐代谢、酸抵抗、黏附侵袭能力以及抗氧化应激等功能,对沙门菌毒力以及致病性有重要意义。肠炎沙门菌编码两种RyhB同源物,RyhB-1和RyhB-2,二者均包含一段33 bp保守序列,可通过调控相同或不同毒力因子调节沙门菌毒力。stdA基因是伤寒沙门菌std菌毛基因簇主要亚基,编码StdA菌毛蛋白,与沙门菌黏附功能密切相关;invH是TTSS-1分泌的效应子,编码三型分泌系统的外环结构,对沙门菌侵袭功能有重要作用。课题组前期利用转录组测序发现,模拟肠道条件下RyhB缺失导致stdA、invH转录水平显著下降,推测RyhB调控invH、stdA的表达。为探究RyhB能否通过调控invH、stdA的表达,进而调控沙门菌致病性,本研究利用荧光定量PCR和western blot技术分别在mRNA水平和蛋白水平进行验证,并在体内外水平研究RyhB是否通过调节毒力基因invH和stdA的表达调控沙门菌致病性。结果表明,模拟肠道条件下,RyhB缺失导致invH和stdA的mRNA水平和蛋白水平显著降低,表明RyhB正调控invH和stdA的表达,与前期转录组测序结果一致。Caco-2细胞黏附、侵袭结果发现,RyhB或invH单缺失均导致沙门菌侵袭Caco-2细胞能力显著下降;RyhB单缺失株侵袭能力高于invH单缺失株,而RyhB和invH同时缺失时,沙门菌侵袭细胞数量显著减少,低于invH单缺失株,表明RyhB可通过调节invH的表达促进沙门菌侵袭功能。黏附试验结果显示,与stdA单缺失株相比,RyhB和stdA同时缺失时,沙门菌黏附细胞数量显著减少。说明沙门菌RyhB和StdA均可促进沙门菌对宿主细胞的黏附,但RyhB能否直接调控stdA还需进一步研究。动物感染实验结果表明,感染第5天和第7天时,与invH单缺失株相比,ryhB-2和invH同时缺失导致沙门菌在脾脏、肝脏和小肠中的定植数量显著下降,而在感染第7天时,与invH单缺失株相比,ryhB-1和invH同时缺失导致沙门菌在肝脏和小肠中的定植数量显著下降,说明RyhB可能在感染早期通过调控invH促进沙门菌在雏鸡体内定植。另一方面,stdA单独缺失时沙门菌在脏器中的定植数量最低,与stdA单缺失相比,RyhB与stdA同时缺失后沙门菌在脏器中的定植数量均显著增加,表明stdA作为毒力基因对促进沙门菌体内定植具有重要作用,但RyhB能否通过调控其表达促进体内定植还需进一步研究。Fur是调节铁代谢的全局性调控蛋白,可在低铁环境下解除对RyhB的负调控作用,促进RyhB抑制铁存储相关蛋白的表达,维持胞内铁平衡。Fur能否影响RyhB对靶基因invH和stdA调控,以及对沙门菌致病性调节未见报道。本研究首先利用λ-Red同源重组技术构建fur、fur/ryhB-1、fur/ryhB-2缺失株以及相应回补株,在模拟肠道条件下检测各菌株毒力基因invH、stdA mRNA水平,并利用Caco-2细胞黏附、侵袭实验探究Fur对RyhB调节黏附、侵袭能力的作用。结果表明,fur在模拟肠道条件下可显著降低invH表达量,并可通过调控RyhB促进RyhB靶基因stdA的表达。另一方面,细胞黏附、侵袭结果证明fur可通过调节RyhB促进沙门菌侵袭能力。