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背景与目的:梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)引起的严重危害人类健康的性传播疾病,其传播途径与艾滋病相同,且可明显增加感染和传播艾滋病的危险性。近年来梅毒发病率跃居我国各类性传播疾病之首,快速准确的诊断对于预防和控制梅毒具有重要意义。迄今为止,Tp的致病机制和致病物质仍不清楚,细菌鞭毛蛋白作为一种经典病原相关分子模式,在促进病原体侵袭和诱导宿主炎症反应中发挥重要作用。角质形成细胞是皮肤屏障中重要的免疫前哨细胞,参与皮肤免疫炎症反应。因此,我们推测:Tp鞭毛蛋白可能通过诱导角质形成细胞表达基质金属蛋白酶,进而降解细胞外基质,引起皮肤免疫炎症反应并促进Tp侵袭。本研究旨在通过原核表达重组Tp鞭毛蛋白,分析其免疫原性和免疫反应性,评价其是否具有候选抗原的价值。同时,以人皮肤角质形成细胞为靶细胞,明确Tp鞭毛蛋白能否通过TLR5激活角质形成细胞表达基质金属蛋白酶,阐明Tp鞭毛蛋白诱导角质形成细胞基质金属蛋白酶的相关信号通路。本研究将为阐明Tp分子致病机制提供新思路和依据,对梅毒防控具有重要现实意义。方法:1.以Tp Nichols标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Tp鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3全基因片段;构建p ET28a-Fla B1(Fla B2、Fla B3)原核表达载体;酶切、测序鉴定后,转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中。2.IPTG诱导重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3表达,Western Blot对表达产物进行分析和鉴定;用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度。3.以Tp Nichols株,Chicago株和Tp临床分离株(nhgz01和nhgz02)建立梅毒感染动物模型,收集感染兔血清,Western Blot检测重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3与感染兔血清和梅毒患者血清的免疫反应性。4.重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3免疫新西兰兔,收集免疫血清,Western Blot和ELISA法检测重组蛋白的免疫原性和免疫反应性。5.建立重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3 ELISA方法,检测各期梅毒患者血清、交叉血清及阴性血清中特异性Ig G和Ig M,初步评价重组蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3在梅毒血清学诊断中的应用价值。6.培养人永生化的角质形成细胞(Ha Ca T),以10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3分别刺激Ha Ca T细胞48h后,蛋白芯片检测基质金属蛋白酶的表达变化。7.以不同浓度0.1、1、10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3分别刺激Ha Ca T细胞24h后,RT-PCR检测MMP-9、MMP-13的m RNA表达水平,明胶酶谱实验和Western Blot检测MMP-9的活性和表达水平,ELISA法检测MMP-13的表达水平。8.Ha Ca T细胞转染2μg TLR5、TLR2、TLR4、My D88特异性干扰质粒和对照质粒后培养24h,随后用10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激培养48h,Western Blot和ELISA分别检测MMP-9、MMP-13的表达变化。9.分别用终浓度为10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞15min、30min、60min、120min后,Western Blot检测ERK、JNK、p38磷酸化水平。10.分别用终浓度为10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞15min、30min、60min、120min后,Western Blot检测细胞中总IκBα的降解水平,磷酸化IκBα的表达水平。用10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞2h后,免疫荧光检测NF-κB p65亚基核转位情况。11.采用特异性抑制剂ERK(10μM PD98059)、JNK(20μM SP600125)、p38MAPK(10μM SB203580)、NF-κB(10μM BAY117082)预处理Ha Ca T细胞后,用终浓度为10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞48h,Western Blot和ELISA分别检测MMP-9、MMP-13的表达变化。结果:1.PCR扩增获得与目的片段大小相符的基因片段:Fla B1(861bp)、Fla B2(861bp)、Fla B3(858bp),重组质粒经测序鉴定与目的基因一致。2.IPTG诱导表达出相对分子量约为36 k Da(Fla B1),35 k Da(Fla B2),34 k Da(Fla B3)的目的蛋白,经Ni2+-NTA纯化后BCA测定浓度约为2mg/m L。3.在新西兰兔感染Tp Nichols标准株,Chicago株及Tp临床分离株(nhgz-01和nhgz-02)后获取的梅毒感染兔血清,以及梅毒患者血清中均检测到Fla B1、Fla B2和Fla B3特异性抗体的表达。4.Tp鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3在初次免疫后7天,抗血清中即可检测出鞭毛蛋白的相应Ig G抗体,三次免疫后获取的免疫血清效价达到1:51200。5.各蛋白Ig G ELISA总的敏感性分别为:Fla B1(95.4%)、Fla B2(92.6%)和Fla B3(95.1%),在Ig M ELISA中,重组蛋白对一期梅毒和先天梅毒表现了较好的敏感性,其敏感性分别为:Fla B1(76.8%,83.1%)、Fla B2(72.0%,87.7%)和Fla B3(74.4%,89.2%);Ig G ELISA总的特异性分别为:Fla B1(98.9%)、Fla B2(95.8%)和Fla B3(95.8%),在Ig M ELISA中,其特异性分别为:Fla B1(96.8%)、Fla B2(97.9%)和Fla B3(95.8%)。6.鞭毛蛋白诱导Ha Ca T表达多种MMPs和TIMP,其中MMP-13,TIMP-1,TIMP-2在三组中表达量均明显升高;仅Fla B1可诱导MMP-9的表达量显著升高。7.Fla B1诱导MMP-9 m RNA和蛋白表达呈浓度依赖性,10μg/m L Fla B1可诱导MMP-9 m RNA和蛋白表达水平显著升高。MMP-13 m RNA和蛋白表达水平也呈浓度依赖性,当蛋白浓度达到10μg/m L时,可引起MMP-13 m RNA和蛋白表达水平显著升高。8.Ha Ca T细胞转染TLR5和My D88干扰质粒后可显著抑制MMP-9、MMP-13的表达,而转染TLR2和TLR4干扰质粒后,MMP-9、MMP-13的表达量无明显改变。9.Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞后可诱导ERK、JNK、p38发生不同程度磷酸化且呈一定的时间依赖性。10.Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞后,IκBα发生不同程度的降解和磷酸化且呈一定的时间依赖性。Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞2h后,NF-κB p65亚基发生了不同程度的核转位。11.Ha Ca T细胞采用特异性抑制剂处理后,Fla B1诱导MMP-9的表达量被显著抑制,但是p38特异性抑制剂SB203580处理细胞后,MMP-13的表达水平与对照组比较,无显著性差异。结论:1.梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3具有较强免疫活性,能够诱导机体产生特异性免疫应答,可做为梅毒血清诊断候选抗原。2.梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3经TLR5/My D88依赖途径激活Ha Ca T细胞表达MMP-9和MMP-13。3.MAPK和NF-κB信号通路参与调控梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3诱导Ha Ca T细胞表达MMP-9和MMP-13。