论文部分内容阅读
本研究以蝴蝶兰（Phalaenopsis hybrid）为研究对象，克隆获得蝴蝶兰ACC合成酶的基因片段，构建了反义基因的植物表达载体。采用根癌农杆菌介导法，将ACC合成酶反义基因导入蝴蝶兰，并对蝴蝶兰的转化植株进行GUS组织化学染色检验和筛选，还对蝴蝶兰的转化植株进行了PCR分子检验。主要研究结果如下：（1）蝴蝶兰ACC合成酶基因的克隆与序列分析根据NCBI中已报道的蝴蝶兰ACC合成酶基因序列设计引物，从蝴蝶兰总RNA中克隆出ACS保守区的461bp片段，连接至克隆载体pMD19-T后转化E.coli DH5α，通过菌落PCR、双酶切、测序鉴定，得到ACS基因片段的克隆。（2）蝴蝶兰ACS反义基因中间载体pBI221-ACS的构建与鉴定完成基因的克隆和测序后，利用DNA重组技术，将蝴蝶兰ACS基因片段以反义的方向插入到中间载体pBI221CaMV35S启动子的下游，后转化E.coli DH5α，通过质粒PCR、双酶切、电泳鉴定，证明蝴蝶兰ACS反义基因中间载体pRI221-RACS成功构建。（3）蝴蝶兰ACS反义基因植物表达载体pCAMBIA3301-RACS的构建与鉴定将中间载体pBI221-RACS酶切后，获得含有CaMV35S启动子的ACS反义基因片段。将此包含启动子的反义基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA3301中，获得ACS基因反义植物表达载体，后转化E.coli DH5α，通过质粒PCR、双酶切、电泳鉴定，证明蝴蝶兰反义基因植物表达载体pCAMBIA3301-RACS成功构建。（4）pCAMBIA3301-RACS质粒转化根癌农杆菌将重组质粒pCAMBIA3301-RACS通过直接转化法导入根癌农杆菌EHA105中，用利福平（Rif）和卡那霉素(Kana)进行筛选得到阳性克隆，通过质粒PCR、双酶切鉴定，证明重组质粒成功转化根癌农杆菌EHA105。（5）植株再生体系的建立采用无菌蝴蝶兰种子为材料，以MS为基本培养基，筛选出播种培养基：1/3MS+KT0.5mg/L+AC1.0g/L+蛋白胨1g/L+椰汁15.0%，分化培养基：1/3MS+NAA0.5mg/L+6-BA5.0g/L，增殖培培养基：Hyponex12.5g/L+Hyponex20.5g/L+6-BA5.0g/L+椰汁10.0%，生根培养基：Hyponex13.0g/L+NAA0.3mg/L。（6）转化体筛选及植株再生将预培养2-3天的外植体与农杆菌菌液浸染90-120分钟后，共培养2-3天，然后转化到含Mer和PPT的选择培养基上进行分化筛选，转入外源基因的原球茎将会在这一系列筛选过程中发芽、生根，获得转基因植株。（7）转基因植株PCR检测采用GUS组织化学染色法对蝴蝶兰的转化植株进行了检验和筛选，并用PCR对蝴蝶兰的转化植株进行了分子检验，得到了反义基因的转化植株。