疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒性传染病，尤其在热带、亚热带地区流行广泛。据WHO统计，全球每年有近3-5亿人感染疟疾，其中约300万人死亡。在我国也有24个省、市及自治区不同程度地存在疟疾流行。据我国卫生部疟疾委员会最新资料显示，南部地区如云南、广西、海南等省疟疾发病率较往年都有不同程度的提高，因此，疟疾的防治始终是寄生虫病研究的重点之一。疟疾的诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节，目前疟疾诊断技术正朝着简便、快速、灵敏、特异及结果易于判定的方向发展，而以单抗为基础的Dipstick免疫层析技术具有以上优点，应用前景广泛。本研究旨在利用疟原虫的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)为诊断靶抗原，通过对该蛋白进行克隆、表达，制备单抗，并筛选、配对建立反应模式等系列研究，开发用于疟疾快速诊断的免疫层析检测试剂盒。 研究中，首先将恶性疟原虫的LDH(Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase, LDHpf)基因克隆至pET-23a(+)表达载体中，构建pET23-LDH重组质粒。重组质粒在BL21中得到高效表达，SDS-PAGE显示表达蛋白分子量约为33KDa，与先前报道的疟原虫LDH分子量理论值(31-36Kda)基本符合。表达产物冰浴超声破菌，发现目的蛋白大部分溶于上清中，为可溶性表达，密度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的41.2％。采用Q-Sepharose High Performance阴离子交换树脂柱层析对pET23-LDH重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳经凝胶光密度图象分析系统检测主蛋白纯度可达89.1％，浓度为400μg／ml。用纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠制备免疫血清，ELISA结果显示免疫小鼠血清与pET23-LDH表达产物出现明显反应，而对空载体PET一23a表达产物无反应。westernblot分析表明特异性区带出现在33kDa处，而空载体诱导后表达的产物无区带出现。进一步用该免疫血清与恶性疟原虫和间日疟原虫反应，western b10t结果表明免疫血清能识别恶性疟原虫和间日疟原虫33KDa处虫源蛋白，而与未感染的红细胞不发生交叉反应，提示pET23一LDH重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。 以纯化后的LDH重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行融合，融合细胞用队T培养基作选择性培养。采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得n株能分泌高效价和高特异性的抗LDH重组蛋白单抗的杂交瘤细胞株。工g类与亚类鉴定结果为2Bll、3C9、3DIO、6D3、7D2、IE7、6G7、IC6、2D7重链类型为1 9 Gl亚类，轻链为K型;2F12重链类型为1 9 GZ亚类，轻链为K型;2C6重链类型为1 gGI亚类，轻链为人型。n株单抗培养上清的ELISA效价为1:100~1:400，腹水效价为l:6400一1:51200。从而可为恶性疟原虫免疫胶体金快速诊断试剂盒的研制提供抗体。 利用饱和硫酸按纯化后的n株单抗，建立了同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫的G工以法。两次筛选的结果显示以3C9包被抗体，IE7标记抗体为GICA较适反应模式。以此反应模式对重组抗原Ing/m1，sng/ml，10ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml进行测定，其最低检测量为5 ng/ml，并且结果呈现较好的梯度，说明反应线颜色的深浅与抗原含量成正比。用制备的免疫层析条对30例恶性疟病人血样、40例间日疟病人血样及100例正常人血样进行检测，恶性疟的敏感性为83.3%，间日疟敏感性为57.5%，特异性均为98%。 虽然在敏感性较国外试剂盒还有差别，但提示我们LDHPf为检测靶抗原是可行的，如在单抗的制备、GIGC工艺上做进一步完善，开发出同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫的试剂盒指日可待。