研究背景肺癌是当今癌症死亡的最常见的原因,在过去的10年里,肺癌的5年生存率仍保持在15%左右,其中耐药性的产生、肿瘤的复发与转移是影响患者生存率的主要原因。对这一现象深入研究,发现肿瘤干细胞(CSCs)与肿瘤的发生、发展、转移及耐药性密切相关。目前,已经有越来越多的实验研究证明,肿瘤的复发、转移与肿瘤干细胞的存在有着密切关系。以肿瘤干细胞为治疗靶点,可以有效预防肿瘤的复发、转移,并且该观点已经在多项前期基础实验中得到证实。血瘀证是中医证侯中常见的证侯之一,其在肺癌等实体瘤中也占据主要地位。前期实验研究已经证实肺癌等肿瘤患者普遍存在血瘀证,其严重程度可以从肿瘤患者血小板表面粘附蛋白表达的强度和数量得到证实。在活血药物方而,我们观察了鸡血藤、水蛭、川芎、苏木对肺癌微转移的影响,结果显示苏木、川芎嗪对肿瘤转移具有更明显的抑制作用。同时在体内实验中,苏木、鸡血藤及二者联合顺铂可以将肿瘤细胞阻滞在GO/G1期,并且可以抑制与细胞增殖相关的蛋白PCNA、HIF-1 a表达,另外对P16-Cyclin D1-CDK4-RB途径也具有调节作用,三者相互作用共同阻滞肿瘤的发生发展。本研究即是在前期研究的基础上,结合现在备受关注的CSCs理论,以川芎、苏木作为活血药的代表药物,观察不同剂量活血药苏木、川芎在体内实验中对肺癌干细胞样细胞的干预作用及其相关机制。研究目的1.采用无血清球培养法分选PG-BE1干细胞样细胞亚群,并鉴定所获得的球细胞具有无限增殖、抗凋亡、高表达肿瘤干细胞标志物等肿瘤干细胞样细胞性能。2.建立PG-BE1干细胞样细胞荷瘤小鼠模型,通过检测瘤体内ABCG2蛋白的表达,观察苏木、川芎在体内环境中对肺癌干细胞样细胞的干预作用。3.通过研究川芎、苏木对肿瘤组织内HIF-1 α、EMT相关标志蛋白的影响,探索活血药对PG-BE1干细胞样细胞的干预作用的相关机制,即可能是通过改善干细胞样细胞所处的低氧微环境、抑制EMT发生起作用的。研究方法1.采用无血清成球培养法分选PG-BE1细胞系中的干细胞样细胞亚群,并采用流式细胞检测、细胞调亡检测、CCK-8检测及western blot检测干细胞相关标志(ABCG2、SOX-2、OCT-4、Nanog)等验证其干性。2.建立PG-BE1干细胞样细胞动物模型,采用激光共聚焦、western bIot、 RT-PCR分别检测瘤体内ABCG2蛋白表达,观察不同剂量的川芎、苏木对PG-BE1干细胞样细胞的干预作用。3.采用免疫组化、western blot、 RT-PCR分别检测瘤体内HIF-1 α、EMT相关标志蛋白的表达,观察川芎、苏木对PG-BE1干细胞样细胞干预作用的相关影响机制。研究结果1.无血清球培养的PG-BE1细胞在培养至第三天时,开始形成小的细胞球,培养到第6-7天时,细胞球表面颜色变暗、折光率降低,传代至第三代时,球体更规则、立体。CCK-8实验提示PG-BE1球细胞组第3、4、5、6、7天的OD值明显高于PG-BE1贴壁细胞,二者之间具有统计学差异,P<0.01；细胞凋亡检测提示PG-BE1球细胞与PG-BE1贴壁细胞早期凋亡率分别为为0.47%、3.54%,中晚期凋亡分别为1.99%、3.12%,总凋亡率分别为2.46%、6.68%,PG-BE1球细胞的早期凋亡率、总凋亡率均低于PG-BE1贴壁细胞,P<0.05,二者具有统计学差异；流式细胞检测发现PG-BE1球细胞高表达CD44+/CD24-标志物,所占比例达99.02%；免疫荧光检测提示,PG-BE1球细胞中ABCG2呈高表达,而PG-BE1贴壁细胞ABCG2蛋白呈低表达甚至不表达状态,两组之间表达具有明显差异；western blot检测提示,ABCG2蛋白在PG-BE1球细胞中的表达量明显高于PG-BE1贴壁细胞,Oct-4、Nanog在PG-BE1贴壁细胞中不表达或低表达,而在PG-BE1球细胞中可见明显表达,SOX-2在PG-BE1球细胞及贴壁细胞中的表达也具有明显差异,其中Oct-4、SOX-2两组中P<0.01, Nanog组、ABCG2组中P<0.05。2.激光共聚焦检测发现,不同浓度川芎可以明显抑制ABCG2蛋白的表达；单用DDP可以抑制ABCG2蛋白的表达,与苏木、川芎配合使用,可以在单用活血药的基础上不同程度增强对ABCG2蛋白的抑制作用,其中高、低剂量苏木+DDP组的抑制作用较强；western blot发现,低剂量川芎对瘤体内ABCG2蛋白有明显的抑制作用,二者具有明显统计学差异,P<0.05,单用DDP组可抑制ABCG2蛋白的表达,不过二者并不具有统计学差异,P>0.05；低剂量川芎+DDP组具有明显抑制ABCG2蛋白的作用,不过与单用低剂量川芎相比,二者并不具有统计学差异,P>0.05; RT-PCR检测发现,低剂量川芎组可明显下调ABCG2 mRNA的表达,二者具有明显统计学差异,P<0.05；低剂量川芎与DDP配合使用,对ABCG2 mRNA的表达并无明显抑制作用。3.免疫组化检测提示,除低剂量苏木外,各组均可抑制HIF-1 α表达,与对照组相比均有统计学差异,P<0.05,单用DDP组可明显抑制HIF-1 α表达,配合低剂量苏木、川芎联合使用可以在单用低剂量苏木、川芎的基础上增强抑制作用,且具有明显统计学差异,P<0.05; western blot检测发现,低剂量川芎与对照组相比可以有效抑制HIF-1 α蛋白的表达,二者之间具有统计学差异,P<0.05；而单用DDP可以明显抑制HIF-1 α蛋白表达,而单用川芎与川芎配合使用DDP两组之间并无统计学差异,P>0.05; RT-PCR检测发现,低剂量苏木、川芎可以抑制HIF-1 a mRNA的表达,与对照组相比具有统计学差异,P<0.05。4.免疫组化检测发现,除低剂量苏木组外,各组对E-cadherin蛋白表达均呈促进作用,P<0.05,具有统计学意义；DDP可明显促进E-cadherin蛋白表达P<0.05,不过苏木、川芎配合DDP干预并不能明显促进E-cadherin蛋白表达；高、低剂量苏木均不能抑制N-cadherin蛋白表达,而其余各组N-cadherin蛋白表达均低于对照组,P<0.05; DDP可降低N-cadherin蛋白表达,与苏木、川芎配合使用,较单用苏木、川芎相比,可抑制N-cadherin蛋白表达,二者具有统计学差异,P<0.05；低剂量川芎可抑制Vimentin蛋白的表达,与对照组有统计学差异,P<0.05。单用DDP可以抑制Vimentin蛋白表达,不过不具有统计学差异,P>0.05,与苏木、川芎合用并不能明显增强其抑制作用。western blot检测发现,除低剂量苏木组、DDP外,其余各组均可以促进E-cadherin蛋白表达,低剂量活血药配合DDP使用后,对E-cadherin蛋白的促进作用明显增强,具有统计学差异,P<0.05：除苏木组外,其余各组均可抑制N-cadherin蛋白的表达,具有统计学差异,P<0.05；与DDP配合使用后,对N-cadherin蛋白的抑制作用在单用活血药的基础上不同程度的增强,其中高、低剂量苏木及高剂量川芎具有统计学意义,P<0.05；低剂量活血药可以抑制Vimentin蛋白表达,二者具有统计学差异,P<0.05；单用DDP对Vimentin蛋白的表达并无任何干预作用,与活血药配合使用后,低剂量川芎+DDP组可明显抑制Vimentin蛋白表达,低剂量川芎+DDP组与低剂量川芎组二者并不具有统计学差异,P>0.05；剂量川芎均可抑制Snail转录因子的表达,P<0.05；单用DDP对Snail的表达无作用,配合苏木、川芎使用DDP均不能改善Snail的表达。RT-PCR检测发现,低剂量川芎组可以下调N-cadherin、Vimentin、Snail三者mRNA的水平,与对照组相比具有明显的统计学差异,P<0.05；DDP对N-cadherin、Vimentin Snail三者mRNA表达并无明显作用,苏木、川芎与DDP配合使用后,反而促进了三者mRNA的表达水平,与对照组相比具有统计学差异,P<0.05。研究结论1.经无血清培养获得的球细胞具有较强的增殖能力、抗凋亡能力,高表达ABCG2、Nanog、Oct4、SOX2等肿瘤标志物,证明用此方法获得的PG-BE1球细胞具有干细胞样细胞的干性。2.低剂量川芎对PG-BE1干细胞样细胞的生长有抑制作用,与DDP协同治疗后,其抑制作用并无增强。低剂量川芎对ABCG2蛋白的抑制作用可能与其抑制ABCG2 mRNA的表达相关。因此认为,低剂量川芎对PG-BE1干细胞样细胞的杀伤作用可能是通过抑制ABCG2蛋白在mRNA水平上的表达达到的。3.低剂量川芎可有效抑制HIF-1 α蛋白表达,对其mRNA表达水平并无明显作用,因此低剂量川芎对PG-BE1干细胞样细胞的抑制作用可能与抑制HIF-1 α蛋白表达有关。4.低剂量川芎可能是通过在mRNA水平上抑制EMT相关标志蛋白mRNA的表达,进而达到对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail等蛋白表达的抑制,抑制EMT的发生,达到杀伤肿瘤干细胞的作用。