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家蚕微粒子病是家蚕的高致死性疾病,可给养蚕业造成毁灭性的损失,该病可经胚种传染。准确地诊断家蚕微粒子病,并弄清楚该病垂直传播的分子机制,为生产上有效地控制家蚕微粒子病的流行发生具有重要意义。本研究以广东家蚕品种9·芙×7·湘为实验材料,利用SDS-PAGE电泳、双向电泳和质谱等技术,比较分析不同发育阶段的家蚕在感染微粒子孢子前后各组织蛋白组分的变化情况,主要结果如下:
1.引物V1F/530R可有效地进行诊断不同发育阶段的家蚕幼虫、蛹、卵和蛾等组织是否感染微粒子孢子,在感染微粒子孢子的组织DNA中均可扩增出了大小约450bp左右的目的条带。
2.用pH4~7的IPG胶条分离微孢子虫总蛋白效果比较好,推测认为家蚕微粒子孢子(Nosema bombycis,简称N.b)总蛋白略偏酸性。在相同的条件下,分别用pH3~10和pH4~7的IPG胶条对N.b孢子总蛋白进行双向电泳,经软件分析发现,虽然pH分离度不同,两块胶中均检测到了670个蛋白点,且pH4~7的IPG胶条比pH3~10的IPG胶条蛋白点分离的更清晰。
3.感染家蚕微粒子孢子的不同发育阶段蚕组织易溶蛋白与正常蚕组织易溶蛋白经SDS-*PAGE电泳比较分析,结果家蚕幼虫、蛹和蛾的蛋白中均出现了很多差异蛋白带,卵期仅在正常蚕卵易溶蛋白比感染卵中发现多出了1条36.117 kD的特异蛋白带。除卵期外,感染组织易溶蛋白中均出现了大小约为17 kD的蛋白带,推测该蛋白与N.b侵染有很大关系。感染家蚕微粒子孢子前后不同发育阶段的蚕组织难溶蛋白经SDS-PAGE电泳比较分析,结果发现除卵期蛋白外,其它时期蛋白组分同样出现很多差异蛋白带。感染微粒子孢子的与正常的卵难溶蛋白差异不明显。
4.正常的和感染家蚕微粒子孢子的蚕卵易溶蛋白经双向电泳比较分析发现,在正常蚕卵易溶蛋白中出现了616个蛋白点,在感染蚕卵易溶蛋白中出现了625个蛋白点,其中匹配蛋白点为554个,蛋白点的匹配率接近于90%。正常的和感染家蚕微粒子孢子的蚕卵难溶蛋白经双向电泳比较分析,在正常蚕卵难溶蛋白中出现了498个蛋白点,在感染微粒子孢子蚕卵难溶蛋白中也出现498个蛋白点,其中匹配蛋白点为417个,蛋白点的匹配率为84%。
5.在感染了家蚕微粒子孢子的蚕卵易溶蛋白2-DE图谱中,选取3个与正常卵易溶蛋白2-DE图谱中有差异的蛋白点做质谱分析,鉴定结果分别为卵黄原蛋白前体、酪氨酸单氧化酶和30KD低分子量脂蛋白21G前体。其中首次用质谱在感染家蚕微粒子孢子的蚕卵中鉴定出了酪氨酸单氧化酶,其在昆虫体内起着抵抗病原物入侵、解毒,保护等作用,推测认为可作为家蚕卵感染微粒子孢子的标识。卵黄原蛋白前体和30KD低分子量脂蛋白21G前体在感染了微粒子病的蚕卵中的作用还有待进一步研究。