目的：心肌特异表达的激酶TNNI3K的蛋白整体结构类似于整联素关联激酶(intergrin-linked kinase, ILK)。研究表明,ILK在心肌发育的调控过程中起至关重要的作用,提示TNNI3K作为一个激酶可能参与了心肌肥厚的调控。本研究的目的是探讨TNNI3K基因在心肌肥厚效应中的作用。方法：(1)用1OOnmol/L的ET-1诱导乳鼠心肌细胞肥大,Real-time PCR方法检测肥大过程中,不同时间点TNNI3K mRNA的表达水平,以证明TNNI3K是否参与了心肌细胞肥大；(2)为了获得足量的TNNI3K基因的过表达腺病毒载体,在HEK293A细胞当中,大规模扩增携带有TNNI3K基因的腺病毒(Ad-TNNI3K),并以氯化铯(CsCl)密度梯度离心法纯化腺病毒；(3)为确定腺病毒介导的TNNI3K在乳鼠心肌细胞里的感染力和最佳剂量,以不同感染复数(MOI)的Ad-TNNI3K感染乳鼠心肌细胞48小时,用可视的绿色荧光蛋白报告基因GFP和western blot方法分别检测腺病毒感染心肌细胞的效率和TNNI3K的表达水平；(4)确定过表达TNNI3K对心肌细胞的肥大效应,实验分为4组：A.感染腺病毒空载体组(对照组)；B.感染TNNI3K腺病毒过表达载体组(正常过表达组)；C.加入ET-1的同时感染腺病毒空载体(肥大对照组)；D.加入ET-1的同时感染TNNI3K腺病毒过表达载体(肥大过表达组)。各组均采用鬼笔环肽-罗丹明染色显示肌小节的重塑情况,共聚焦显微镜分析细胞表面积,3H-leucine掺入检测蛋白合成速率,Real-time-PCR检测心肌胚胎基因(ANF、α-MHC)的表达特征,Western blot检测AKT的磷酸化水平。(5)检测TNNI3K在心肌病组织的表达水平。正常人3例,扩张型心肌病6例,肥厚型心肌病4例,免疫组化检测TNNI3K的表达水平。结果：(1)在ET-1刺激乳鼠心肌细胞肥大的过程中,TNNI3K mRNA的表达水平呈曲线波动,先上调,后减少,再上调；(2)大规模扩增、纯化后,得到了纯度滴度比较高的腺病毒；(3)确定了Ad-TNNI3K感染心肌细胞的最佳剂量为MOI 100；(4)肥大效应检测结果为：与对照组相比,正常过表达组中TNNI3K的过表达,能够增加肌小节的组装,增大心肌细胞细胞表面积,增加蛋白合成速率和a-MHC的表达,并且能够提高AKT的磷酸化水平,但是却降低了ANF的表达；与肥大对照组相比,在肥大过表达组中TNNI3K的过表达,能够增加肌小节的组装,增大细胞表面积,但是在该组中ANF的表达降低,a-MHC的表达和AKT的磷酸化没有显著改变；(5)TNNI3K在扩张型心肌病与肥厚型心肌病中的表达量显著高于正常入组织中的表达量。结论：腺病毒介导的TNNI3K过表达可以诱导乳鼠心肌细胞肥大,加速心肌细胞肥大的进程。TNNI3K参与了心肌肥厚的形成,TNNI3K有可能作为一个靶点治疗心肌肥厚。目的检测TNNI3K基因过表达对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度变化的影响,为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供了可靠有效的研究模型。方法恒压Langedoff灌流装置逆向灌流法分离成年大鼠心肌细胞,之后对该心肌细胞进行逐级复钙。然后,将心肌细胞接种于改良的M199培养基中。分别感染Ad-GFP病毒和Ad-TNNI3K病毒,24小时后,以IonOptix单细胞可视化动缘系统检测心肌细胞肌丝钙敏感度。结果成功分离培养了成年大鼠心肌细胞,并在该细胞中成功过表达了TNNI3K基因。钙敏感度测定结果表明,TNNI3K基因能够增强心肌细胞肌丝钙敏感度。结论在本实验成功分离培养的成年大鼠心肌细胞中以腺病毒载体过表达TNNI3K基因,可增强心肌细胞肌丝的钙敏感度,该模型为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能中的作用及机制奠定了基础。目的：肌小节组装可由微丝结合蛋白调节,是心肌肥厚的表现之一,nexilin作为一种微丝结合蛋白可能参与了肌小节收缩单位的组装。本研究以大鼠nexilin基因为研究对象,探讨nexilin在心肌细胞肥大过程中,nexilin对肌小节的调节及心肌细胞收缩性的作用。方法：(1)检测nexilin在心肌肥厚中的表达,以确定nexilin是否参与了心肌肥厚：以内皮素-1(ET-1)诱导乳鼠心肌细胞肥大,在不同的时间点用Real-time PCR检测nexilin的表达水平；取肥厚型、扩张型心肌病和正常人心肌组织切片,以免疫组化检测nexilin的表达。(2)为研究nexilin在心肌细胞中的功能,克隆nexilin基因片段,进行外源筛靶,将筛到的有效序列用Admax包装系统,构建成为nexilin敲降腺病毒载体。(3)为验证腺病毒介导的nexilin基因过表达和干扰效果,腺病毒经大规模扩增后,在乳鼠心肌细胞里以不同的感染剂量,过表达或敲降nexilin,以western blot检测nexilin的表达水平。(4)为进一步确定nexilin基因在心肌细胞中的定位,以pEGFP-N1-nexilin质粒转染乳鼠心肌细胞,融合表达EGFP-nexilin,以绿色荧光蛋白EGFP指示nexilin的细胞定位；(5)为探讨nexilin是否对心肌细胞的细胞骨架具有调节作用,用nexilin过表达或干扰的腺病毒载体感染心肌细胞：实验分为6组：A.感染腺病毒空载体组(对照组)；B.感染nexilin腺病毒过表达载体组(正常过表达组)；C.感染nexilin干扰腺病毒载体组(正常干扰组)；D.加入ET-1的同时感染腺病毒空载体(肥大对照组)；E.加入ET-1的同时感染nexilin腺病毒过表达载体(肥大过表达组)；F.加入ET-1的同时感染nexilin腺病毒干扰载体(肥大敲降组)。各组均采用鬼笔环肽-罗丹明染色显示肌小节的重塑情况。(7)为证明肌丝改变对心肌细胞收缩性的调节作用,以nexilin过表达或干扰的腺病毒感染心肌细胞,分组同前,将处理的心肌细胞用可视化动缘系统检测心肌细胞的收缩性。结果：(1)在ET-1诱导心肌细胞肥大的过程中,nexilin mRNA高表达；nexilin蛋白在肥厚型及扩张型心肌病中高表达,且扩张型心肌病中的表达要高于肥厚型心肌病。(2)获得了nexilin基因片段,筛选到高效敲降nexilin基因的shRNA,并包装进入了腺病毒载体。(3)包装的nexilin干扰腺病毒在MOI为40的时候,有最佳敲降效果；nexilin过表达腺病毒在MOI 40时也能达到比较高的表达水平,在MOI 100时表达量最高。(4)nexilin-EGFP能够掺入并且定位于肌小节；(5)腺病毒载体介导的nexilin过表达或干扰对心肌细胞骨架及收缩性的影响：nexilin基因过表达能够维持加强心肌肌小节的组装,增加心肌细胞收缩幅度、收缩速率和舒张速率；相反,nexilin基因的敲降打散了肌小节的组装,下调了心肌收缩幅度、收缩速率和舒张速率；与正常心肌细胞相比,肥大心肌细胞增加肌小节的组装、增加心肌细胞收缩幅度。结论：nexilin基因通过调节肌小结的组装,来维持心肌细胞形态结构,调节心肌细胞的收缩性,并很可能参与了心肌肥厚的发生发展。