背景膀胱癌是泌尿系统常见的肿瘤,难治疗,复发率高。目前治疗膀胱癌常用药物为卡介苗,但卡介苗毒副作用明显。泌尿系统常用中药猪苓功效为利水渗湿,已有研究显示猪苓可显著抑制大鼠膀胱癌的发生。本课题组前期研究表明,猪苓中有效成分猪苓多糖对体外实验性膀胱肿瘤有抑制作用,其途径可能主要是调控机体非特异性免疫作用。但未见有关猪苓利水功效在膀胱癌治疗中具体机理研究,猪苓对水通道蛋白及Ⅱ相酶调节作用也未见前期研究。本课题主要研究猪苓利水功效在卡介苗对膀胱癌的治疗作用中部分减毒作用机制,并多猪苓对Ⅱ相酶作用做初步探讨。目的1研究猪苓中猪苓多糖及此猪苓多糖主要甲醇部位相对分子量分布、组成及含量,研究使用硫酸-蒽酮分光光度法测猪苓中猪苓多糖含量,并探讨有关实验条件对测定结果的影响。2研究猪苓利尿作用,对尿电解质作用及对肾脏髓质及膀胱中AQPs作用,探讨其利尿作用机理。3研究猪苓、猪苓多糖及联用卡介苗防治BBN联合糖精诱导雌性F344膀胱癌大鼠作用,明确其药效学研究。4探讨猪苓及猪苓多糖干预后肾脏髓质及膀胱中AQPs作用,初步探讨猪苓及猪苓多糖干预后实验鼠肝脏及膀胱中Ⅱ相酶活性变化方法1采用水提醇沉法制备猪苓粗多糖,通过Sevag法除蛋白后再次醇沉并通过透析和冷冻干燥制备纯化的猪苓多糖,通过凝胶渗透色谱及HPLC法对纯化猪苓多糖的相对分子量分布、组成及含量进行研究。为简化猪苓多糖测量手段,使用硫酸-蒽酮分光光度法测猪苓中猪苓多糖含量,并探讨有关实验条件对测定结果的影响。2筛选出测量尿量、尿Na+、尿K+,尿Cl-的正常值范围SD大鼠30只,分为5组,每组6只,分为5组,即生理盐水组,呋塞米组,猪苓50mg/kg组,猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组,经口给药,分别在给药24h及8d后收集尿液,记录尿量,检测尿Na+、尿K+,尿Cl-浓度,以RT-PCR方法测定肾髓质中AQP1, AQP2, AQP3,V2R mRNA含量变化及膀胱中AQP1, AQP3 mRNA含量变化。3膀胱癌模型制作及猪苓及猪苓多糖干预后研究(1)模型制作及药物干预雌性F344大鼠90只,分为9组,即生理盐水组,模型组,猪苓多糖组(130mg/kg),猪苓50mg/kg组,猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组,猪苓加卡介苗组,猪苓多糖加卡介苗组,卡介苗组。除生理盐水组外,其它5组实验大鼠从实验开始到第8周给予含O.05%BBN的饮用水,第8周后,实验大鼠开始给予含5%糖精的饮用水,至第20周截止,从第9周开始给予猪苓及猪苓多糖供试物,给予剂量为lml/100g,给药至实验结束为止,同时从第9周开始给卡介苗组膀胱灌注给予卡介苗,每周一次,总计6周,停药4周后,每3周给药1次,通过H&E染色判定膀胱癌程度。(2)药效学研究每天记录大鼠日常情况,每周固定时间称取大鼠计重,实验结束2周前称取大鼠进食量,记录大鼠膀胱、脾脏、胸腺组织重量,记算大鼠膀胱指数、脾脏指数、胸腺指数,测定大鼠血肌酐清除率。4猪苓及猪苓多糖预防BBN联合糖精诱导大鼠膀胱癌机理研究(1)以RT-PCR方法测定肾髓质中AQP1, AQP2, AQP3,V2R mRNA含量变化及膀胱中AQP1, AQP3 mRNA含量变化,以免疫组化定位肾脏组织AQP1. AQP2. AQP3及膀胱组织AQP1, AQP3表达位置。(2)使用ELISA法对正常大鼠膀胱GST, NQO1酶及膀胱癌实验鼠肝脏CYP450、GST,NQO1酶活性测定；以RT-PCR方法测定实验大鼠肝脏组织及膀胱组织GSTPi和NQOlmRNA含量变化。结果1猪苓多糖数均相对分子质量为48232,重均相对分子质量为117506,分子宽为2.44；其可能由海藻糖和葡萄糖组成,其含量分别为6.05%和62.28%。猪苓多糖33%甲醇部位数均相对分子质量为82798,重均相对分子质量为174137,分子宽为2.10；其可能由棉籽糖、海藻糖和葡萄糖组成,其含量分别为1.78%、18.86%和72.69%。蒽酮-硫酸法测的猪苓多糖含量为28.8%,猪苓多糖多糖含量为87.9%,蒽酮-硫酸法所测多糖含量高于HPLC法所测含量。2单次给药后,猪苓50mg/kg,250mg/kg剂量在1h和4h内有明显利尿作用,所有实验组在6h后均可产生显著的利尿效应,所有剂量猪苓均可显著提高大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平；给药8d后,猪苓有显著性利尿效果,所有剂量猪苓均可显著提高大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平。给药8天后猪苓及呋塞米组大鼠肾脏髓质AQP1和AQP3 mRNA相对表达含量与对照组比较,差异无显著性差异；猪苓可明显上调AQP2的mRNA水平,50mg/kg和250mg/kg剂量猪苓也可明显上调V2R的水平,值得关注的是,低剂量猪苓上调AQP2, V,R的mRNA作用最显著。3膀胱癌模型制作及猪苓、猪苓多糖及卡介苗干预后药效学研究(1)模型组及猪苓多糖组实验大鼠与正常组比较,略显消瘦；卡介苗组大鼠死亡7只,死亡前出现腹水、血尿、消瘦等症状；猪苓加卡介苗组大鼠死亡5只,死亡情况与卡介苗组相似；猪苓多糖加卡介苗组大鼠情况较佳,死亡2只,其它存活大鼠大体状况与正常组比较,未见明显改变；其它各组与正常组比较,未见显著改变。(2)猪苓多糖组体重在实验过程中多个实验记录点有下降,与对照组比较,差异有显著性差异,卡介苗组体重也明显下降,其它各组体重与对照组比较,除个别组于个别时间记录点有明显下降外,其它大部分实验记录点均未见明显差异(3)各组实验大鼠实验结束前2周进食量比较,无显著性差异。(4)膀胱癌模型组及猪苓加卡介苗组大鼠膀胱指数与正常组比较,明显增加,差异有显著性差异,其它各给药组膀胱指数与正常组比较,差异无显著性差异。猪苓加卡介苗组大鼠膀胱指数与模型组比较,,明显增加,差异有显著性差异。模型组大鼠脾脏指数与正常比较,显著增加,统计有显著性差异,其他各组大鼠脾脏指数与正常组比较,差异无显著性差异。猪苓加卡介苗组大鼠胸腺指数与正常组比较,明显降低,差异有显著性差异,猪苓500mg/kg组及猪苓加卡介苗组胸腺指数与模型组比较,明显降低,差异有显著性差异,其它各组与正常组及模型组比较,差异无显著性差异。(5)将各组血肌酐清除率与正常组比较,猪苓多糖组与与正常组比较,明显增加,差异有显著性差异,其它各组与正常组比较,差异无显著性差异。(6)根据膀胱癌分级依据,模型组中存活9只大鼠中有8只可判定为膀胱癌,其中属pT2类别的为4只,模型制作成功。猪苓多糖组存活的7只大鼠中有4只可判定为膀胱癌,其中属pT2类别的为2只,结果显示猪苓多糖对BBN诱导大鼠膀胱癌具有一定的预防作用。猪苓50mg/kg组,猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组存活大鼠分别为10只,9只和10只,其中属膀胱癌类别的分别为2只,3只和1只,结果显示猪苓对对BBN诱导大鼠膀胱癌具有较佳的预防作用,其中低剂量组和高剂量组预防作用最佳。猪苓加卡介苗组存活大鼠为5只,其中属于pTa级为3只,猪苓多糖加卡介苗组存活大鼠为8只,其中pTa级为4只,卡介苗组存活大鼠为3只,pTa级为去1只。4猪苓及猪苓多糖预防BBN联合糖精诱导大鼠膀胱癌机理研究(1)在膀胱组织中,AQP1主要表达于膀胱粘膜下微血管和小动脉的内皮细胞,AQP3主要表达于膀胱粘膜上皮细胞的细胞膜及胞质中。在肾脏组织中,AQP1主要分布于细胞膜,位于肾脏近曲小管和亨氏袢降支细段管腔膜、基膜及直小血管降部；AQP2主要分布于集合管主细胞管腔膜及细胞内囊泡中；AQP3主要分布在皮质和外髓集合管。(2)猪苓多糖组及猪苓50mg/kg组,猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组对AQP2和AQP3 mRNA表达无明显上调或下调。猪苓多糖组及猪苓50mg/kg组,猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组AQP1mRNA表达明显上调,其中低剂量猪苓AQP1mRNA表达上调作用最大。猪苓多糖组及猪苓50mg/kg组,猪苓250mg/kg组，猪苓500mg/kg组V2RmRNA表达明显下调,其中低剂量及中剂量猪苓V2RmRNA表达下调大。(3)与模型组比较,猪苓多糖组及猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组AQP1mRNA表达明显下调；同时与模型组比较,猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组对AQP3mRNA表达明显下调。4.猪苓及猪苓多糖干预后Ⅱ相酶变化(1)猪苓50mg/kg,猪苓250mg/kg,猪苓500mg/kg对正常组膀胱中GST和NQ01酶含量无明显影响。(2)猪苓多糖及猪苓50mg/kg,猪苓250mg/kg组,猪苓500mg/kg组明显降低膀胱癌大鼠肝脏微粒体中CYP450酶活性；猪苓多糖组及猪苓50mg/kg,猪苓250mg/kg,猪苓500mg/kg明显降低肝脏微粒体中GST酶活性；猪苓多糖及猪苓50mg/kg,猪苓250mg/kg,猪苓500mg/kg明显升高肝脏微粒体中NQO1酶活性。(3)猪苓多糖及猪苓50mg/kg,猪苓250mg/kg,猪苓500mg/kg明显上调实验大鼠膀胱组织GSTPi及NQOlmRNA表达,其中,低剂量猪苓上调膀胱组织GSTPi及NQOlmRNA表达作用最大。(4)猪苓多糖组及猪苓组500mg/kg实验大鼠肝脏GSTPi mRNA相对表达含量上调,差异有显著性差异,其它各组与与正常组比较,GSTPi及NQOlmRNA表达无显著性差异。结论1猪苓多糖数均相对分子质量为48232,重均相对分子质量为117506,分子宽为2.44；猪苓多糖可能由可能由海藻糖和葡萄糖聚合而成,其含量分别为6.05%和62.28%,其中葡萄糖占其中绝大部分。2猪苓多糖33%甲醇萃取部位数均相对分子质量为82798,重均相对分子质量为174137,分子宽为2.10；其可能由棉籽糖、海藻糖和葡萄糖组成,其含量分别为1.78%、18.86%和72.69%。硫酸蒽酮法测的猪苓中多糖含量为28.8%,猪苓多糖中多糖含量为87.9%；测定多糖含量方面,HPLC法较硫酸-蒽酮法准确。3猪苓可显著提高大鼠尿量,尿Na+,尿K+和尿Cl-水平,其利尿活性为通过调节降低肾脏髓质AQP2表达产生,并且通过降低肾脏髓质V2R降低AQP2表达产生。4猪苓、猪苓多糖及卡介苗可有效抑制BBN联合糖精诱导雌性F344大鼠膀胱癌,猪苓多糖联合应用卡介苗可有效降低卡介苗毒副作用。5猪苓及猪苓多糖可下显著调膀胱癌实验鼠膀胱组织中AQP1和AQP3 mRNA含量；显著上调膀胱癌实验鼠膀胱组织中Ⅱ相酶GSTPi和NQOl mRNA含量,显示猪苓及猪苓多糖可能通过调节AQPs和Ⅱ相酶预防膀胱癌的发生。