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谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是氨基酸的主要生产菌,每年产氨基酸超过600万吨,在食品、医药与健康领域中具有重要的地位。对菌种进行大范围的基因组工程改造,是获得优良谷氨酸棒杆菌菌株的重要手段。然而目前缺乏可以装载大片段并导入谷氨酸棒杆菌稳定复制的载体工具,导致谷氨酸棒杆菌基因组大范围编辑受到限制。本研究构建了大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pCGBACT1。该穿梭载体可以装载大片段DNA,并通过细菌接合(bacterial conjugation)从大肠杆菌转移至谷氨酸棒杆菌中,形成稳定的复制子。本研究获得的大容量穿梭载体及其构建策略,可为解决谷氨酸棒杆菌的大片段DNA导入问题提供参考。主要结果如下:(1)将谷氨酸棒杆菌天然大质粒pTET3中含有par A、par B、repA基因及22 bp-box的3.7 kb DNA片段重新合成并克隆至pOK12,得到的pOK12CG1质粒可转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032并稳定复制,证明该3.7 kb片段含有谷氨酸棒杆菌质粒复制与分配序列。以该3.7 kb片段、大肠杆菌细菌人工染色体(BAC,bacterial artificial chromosome)载体pBelo BAC11骨架与RP4质粒的ori T序列为功能模块,构建了大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pCGBACT1。进一步的实验显示pCGBACT1可通过细菌接合从大肠杆菌S17-1转移至谷氨酸棒杆菌ATCC13032,且与谷氨酸棒杆菌pBL1系列、pGA1系列质粒相容。(2)将酵母CEN/ARS序列及HIS3基因引入pCGBACT1,得到大容量穿梭载体pCGBACYT1。以线性化的pCGBACYT1为骨架,分别与2-12条4-6 kb的DNA片段共同转化进行并进行体内重组,实现了从10 kb到60 kb的大片段DNA组装。从酵母转化子中提取携带大片段DNA的重组质粒后,以大肠杆菌S17-1为中间宿主,通过细菌接合作用实现40 kb大片段DNA向谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的转移,并形成了稳定的复制子。