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目的:研究SFTSV核蛋白核酸疫苗的免疫原性。方法:1.以SFTSV HB29株为参考病毒株,选取其核蛋白编码基因（GenBank:HM745932.1）,并用软件OptimumGeneTM分析核蛋白的基因序列,找出其密码子使用偏好及与哺乳动物、大肠杆菌密码子使用偏好不同的位点,用哺乳动物和大肠杆菌都偏好的密码子替代SFTSV核蛋白基因中使用偏好不同的密码子,氨基酸序列保持不变,设计出密码子优化的核蛋白基因序列。经化学合成得到野生型及优化后的基因序列,然后将上述序列分别克隆到真核表达载体pJW4303中构建核酸疫苗pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt。以pJW4303作为阴性对照,分四组进行实验研究。2.通过生物信息学方法预测核蛋白CTL表位肽,并优选其中的四条肽（SN-1、SN-2、SN-3、SN-4）进行后续研究。3.将构建的三种核酸疫苗pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt及阴性对照pJW4303转染293T细胞,Western blot检测转染细胞上清液及裂解液中核蛋白的表达。4.采用肌肉注射、活体基因导入方式免疫BALB/c小鼠,免疫时间点为第0、2、4、8周,收集血清时间点为每次免疫前和第6、10周。通过ELISA方法检测免疫后小鼠血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a水平。5.按上述免疫方法于第0、2、4周免疫BALB/c小鼠,第7、17、31天分批处死小鼠取脾细胞,流式细胞技术检测脾脏淋巴细胞亚群、Elispot实验检测脾脏分泌IFN-γ的淋巴细胞。结果:1.SFTSV核蛋白核酸疫苗及体外表达:（1）野生型序列核酸疫苗pJW4303-N;（2）密码子优化的核酸疫苗pJW4303-N-opt;（3）在密码子优化的基础上5’端引入tPA信号肽的核酸疫苗pJW4303-tPA-N-opt。Western blot检测核酸疫苗体外表达:（1）pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt转染293T细胞后均能正确表达SFTSV核蛋白;（2）pJW4303-N、pJW4303-N-opt在转染的293T细胞裂解液中可见表达,在上清液中未见明显表达;（3）pJW4303-tPA-N-opt在转染的293T细胞上清液、裂解液中均可见高表达。2.抗体应答:（1）pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt在首次免疫后2周,BALB/c小鼠血清中可检测到核蛋白特异性IgG抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度逐渐增高,末次免疫后2周达高峰;（2）末次免疫后2周,pJW4303-N、pJW4303-N-opt组诱导产生的核蛋白特异性IgG抗体滴度间无统计学差异（p>0.05）;pJW4303-tPA-N-opt组核蛋白特异性抗体IgG滴度较前两组明显增高,均有统计学差异（p<0.05）;（3）特异性IgG抗体亚型:pJW4303-N及pJW4303-N-opt均以诱导产生IgG2a为主,pJW4303-tPA-N-opt诱导产生高水平的IgG1和IgG2a。末次免疫后2周,pJW4303-N、pJW4303-tPA-N-opt组的IgG2a水平比较无统计学差异（p>0.05）,均较pJW4303-N-opt组高,差异有统计学意义（p<0.05）;pJW4303-tPA-N-opt组IgG1水平与pJW4303-N、pJW4303-N-opt组相比显著增高,有统计学差异（p<0.05）,pJW4303-N和pJW4303-N-opt组间比较IgG1无统计学差异（p>0.05）;（4）空载体对照组pJW4303免疫后血清均未检测到SFTSV核蛋白特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体;（5）pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt三组的IgG2a/IgG1比值分别为3.81±0.51、2.56±1.03、0.93±0.086,三组间比较有统计学差异（p<0.05）。3.脾脏淋巴细胞亚群:（1）第7天:pJW4303-N-opt组脾脏CD3+T、CD8+T、NK细胞增高明显,与pJW4303-tPA-N-opt组有统计学差异（p<0.05）;其中CD3+T、NK细胞分别与pJW4303组、pJW4303-N-opt组比较有统计学差异（p<0.05）;pJW4303-N和pJW4303-tPA-N-opt组未见明显改变,两组组间比较及与载体pJW4303组比较无统计学差异（p>0.05）;（2）第17天:pJW4303-N-opt组脾脏淋巴细胞增高明显,与pJW4303-tPA-N-opt组均有统计学差异（p<0.05）;pJW4303-N-opt组脾脏CD4+T、CD8+T细胞与pJW4303组比较有统计学差异（p<0.05）,其中CD8+T细胞与pJW4303-N组比较也有统计学差异（p<0.05）;其它细胞组间比较未见统计学差异（p>0.05）;（3）第31天:pJW4303-N-opt组NKT细胞较pJW4303-N组明显降低有统计学差异（p<0.05）;其它各组细胞比较无统计学差异（p>0.05）。4.脾细胞CTL应答:（1）合成多肽SN-4能够刺激上述三种核酸疫苗免疫组小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ;（2）pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt组在第17天开始出现特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞,野生型组则在第31天才出现;（3）第17天:pJW4303-N-opt组分泌IFN-γ细胞数明显多于pJW4303-N、pJW4303-tPA-N-opt组,差异有统计学意义（p<0.05）;pJW4303-tPA-N-opt和pJW4303-N两组间分泌IFN-γ细胞数无统计学差异（p>0.05）,pJW4303-tPA-N-opt组与对照组比较无统计学差异（p=0.056）;（4）第31天:pJW4303-N、pJW4303-N-opt、pJW4303-tPA-N-opt组与对照组相比均有统计学差异（p<0.05）;其中,pJW4303-N-opt组分泌IFN-γ细胞数显著多于pJW4303-N、pJW4303-tPA-N-opt组,差异有统计学意义（p<0.05）;pJW4303-N、pJW4303-tPA-N-opt组组间比较无统计学差异（p>0.05）;（5）SN-1、SN-2、SN-3均不能刺激小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ。结论:1.SFTSV核蛋白核酸疫苗具有良好的体液免疫和细胞免疫原性;2.SN-4是SFTSV核蛋白的一个CTL表位肽。