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背景先天性白内障是导致儿童失明的主要原因之一,大约0.3-1.5/1000的儿童患先天性白内障,在胚胎发育早期,基因功能失调导致晶状体发育异常,是先天性白内障发生的主要原因。目前先天性白内障的致病基因有30多个。其中转录因子基因突变和功能缺陷是诱发先天性白内障的病因之一,如Pax6、Fox E3、Six3、Prox1、Sox2/3、Maf、Pitx3、AP-2a和Hsf4,这些转录因子的激活和失活决定着晶状体发育进程。Hsf4是调控新生儿期晶状体发育的一个关键转录因子。Hsf4敲除的小鼠和斑马鱼会导致晶状体发育异常以及白内障相关表型,主要病理改变为晶状体前囊上皮非正常增生、纤维细胞内变性蛋白堆积和纤维细胞终末分化障碍,因此,Hsf4的转录调控对维持新生儿期晶状体正常发育至关重要,但是我们对Hsf4的转录活性的调控机制还不清楚。Hsf4属于热休克转录因子家族,该家族成员主要通过转录调控热休克蛋白的表达应激外界环境刺激。在哺乳动物细胞中,该家族成员有Hsf1、Hsf2、Hsf3和Hsf4。Hsf1是诱导热休克反应的主要转录调控因子。Hsf4有Hsf4a和Hsf4b两个亚基,Hsf4b是特异性表达于小鼠晶状体中的一个亚基,在晶状体发育期间,作为一个转录激活因子调控小分子热休克蛋白Hsp25、γ-crystallin、β-crystallin和结构蛋白vemintin,filensin和SKAP2的表达。我们之前的研究表明,Hsf4b的转录活性受磷酸化调控。定点突变结果显示,突变Hsf4/T222和S299对Hsf4b的转录活性的调控是不同的。之前检测Hsf4b的磷酸化并没有特异性的Hsf4b磷酸化抗体,并且调控这些位点的磷酸化的蛋白激酶也不清楚。研究Hsf4b的上游激酶对建立调控Hsf4b转录活性的信号通路网络,以及Hsf4b是如何发挥作用在晶状体中具有重要意义。该论文利用订制Hsf4b/S299位点的磷酸化抗体,深入讨论磷酸化修饰Hsf4b/S299的上游激酶和信号通路,以及它们磷酸化修饰S299对Hsf4b转录活性调控的分子机制。基于此可以为我们深入理解磷酸化修饰Hsf4b的转录活性和白内障发生的相关性提供新思路。目的利用我们选择晶状体上皮细胞和BL/C57小鼠晶状体,探究参与修饰Hsf4b/S299位点磷酸化的激酶对Hsf4转录活性的调控机理,及其在晶状体发育中的作用。方法1.制备的p-Hsf4b/S299抗体的验证,晶状体上皮细胞过表达不同标签的野生型Hsf4b蛋白;晶状体上皮细胞过表达不同标签的野生型Hsf4b蛋白进行免疫沉淀实验;晶状体上皮细胞过表达野生型Hsf4b及Hsf4b/S299A,Hsf4b/S299D,Hsf4b/T222A突变的蛋白;过表达野生型Hsf4b蛋白的细胞,细胞裂解液上清用去磷酸化酶Calf intestinal alkaline phosphatase(CIAP)处理。以上均是通过Western-blot检测Hsf4b/S299位点的磷酸化水平以及磷酸化Hsf4b/S299抗体对Hsf4/S299位点发生磷酸化的特异性识别和结合活性。2.晶状体上皮细胞过表达野生型Hsf4b及Hsf4b/S299A位点突变的蛋白,用顺铂(cis)细胞;晶状体上皮细胞过表达野生型Hsf4b及Hsf4b/S299A位点突变的蛋白,用MG132处理细胞;晶状体上皮细胞过表达野生型Hsf4b,用EGF处理细胞;以上我们都是通过Western-blot检测Hsf4/S299位点的磷酸化水平3.晶状体上皮细胞先用EGF处理之后,再用U0126处理,Western-blot检测U0126作用效果最佳的时间;晶状体上皮细胞过表达野生型Hsf4b蛋白,先用EGF处理,再用U0126处理;晶状体上皮细胞过表达野生型Hsf4b及Hsf4b/S299A位点突变的蛋白,分别用顺铂处理这两种细胞,同时过表达野生型Hsf4b蛋白的细胞分别用U0126,SB203580,SP600125处理;过表达了野生型Hsf4b及Hsf4b/S299A突变的晶状体上皮细胞,用MG132处理这两种细胞,而过表达野生型Hsf4b蛋白的细胞同时又用U0126处理;以上都是通过Western-blot检测Hsf4b/S299位点的磷酸化水平。4.晶状体上皮细胞分别过表达野生型Hsf4b(WT),突变Hsf4b/S299A及Hsf4b+MEK1蛋白,用U0126处理过表达Hsf4b+MEK1蛋白的细胞,Western-blot检测Hsf4b/S299和ERK1/2的磷酸化水平。5.HLE(人的晶状体上皮)细胞分别过表达野生型Hsf4b,Hsf4b+MEK1,Hsf4b/S299A突变,以及Hsf4b/S299A突变+MEK1的蛋白,Western-blot检测Hsf4b/S299和ERK1/2的磷酸化水平,以及下游靶基因alpha B-crystallin的蛋白表达。HLE细胞过表达GST-Sumo1+Hsf4b,GST-Sumo1+Hsf4b/S298A,GST-Sumo1+Hsf4b/S299A/K294R,GST-Sumo1+Hsf4b+MEK1蛋白,用U0126处理过表达GST-Sumo1+Hsf4b+MEK1蛋白的细胞,Western-blot检测Hsf4/K294的类泛素化水平。6.取出生3天,7天,2周,2个月,1年C57小鼠的晶状体,Western-Blot检测在不同时间段Hsf4b和Hsf4b/S299蛋白的磷酸化水平。取出生7天的小鼠的晶状体,分离其上皮和纤维,然后进行核质分离实验,Western-blot检测Hsf4b和p-Hsf4b/S299分别在上皮和纤维细胞的细胞核和细胞质中的蛋白表达量;取出生2周小鼠的晶状体,进行组织切片,免疫荧光检测磷酸化Hsf4b/S299蛋白在上皮和纤维细胞中的定位。7.EGF和U0126处理出生1周小鼠的晶状体,Western-blot检测Hsf4b,p-Hsf4b/S299以及其下游靶蛋白水平。结果:1.制备的p-Hsf4b/S299磷酸化抗体能特异性识别不同标签的Hsf4b/S299位点磷酸化的蛋白。2.U0126能够抑制顺铂,MG132和EGF诱导细胞Hsf4b/S299位点的磷酸化。3.MEK1能够介导ERK1/2的激活,进而引起Hsf4b/S299位点的磷酸化。4.MEK1-ERK1/2激活通路能够增加Hsf4b/S299位点的磷酸化水平,降低其下游靶基因alpha B-crystallin的表达,并且激活Hsf4b/K294位点的类泛素化(Sumo)。5.小鼠晶状体中Hsf4b和p-Hsf4b/S299磷酸化修饰的时空表达。p-Hsf4b/S299主要表达于小鼠晶状体上皮细胞的细胞质和纤维细胞的细胞核中。6.在小鼠晶状体组织中,MAP kinase ERK1/2也参与Hsf4b/S299位点的磷酸化,进而调控Hsf4b转录活性。结论:1.在晶状体上皮细胞中,MEK1通过激活ERK 1/2的磷酸化,从而增加Hsf4b/S299位点磷酸化水平。2.通过MEK1-ERK1/2信号通路的激活,使Hsf4b/S299位点发生磷酸化,进而导致其下游靶基因alpha B-crystallin的表达下降。3.在晶状体发育过程中,Hsf4b的转录活性受Hsf4b/S299位点磷酸化的调控。