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目的:以糖酵解作为主要代谢方式的Warburg效应是肿瘤细胞代谢的标志性特征,结直肠癌细胞表现出典型的Warburg效应。肿瘤细胞代谢的异常调控能够显著影响肿瘤细胞的增殖并调控其转移行为。肿瘤细胞通过抑制线粒体基质内丙酮酸脱氢酶多酶复合物（pyruvate dehydrogenase complex,PDHC）的活性,抑制丙酮酸的氧化脱羧转化成乙酰辅酶A,促进葡萄糖经由糖酵解途径分解为生物大分子的合成中间体。在这一过程中,丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinases,PDHKs）发挥着关键作用,PDHKs使PDHC磷酸化并使其失活,而PDHC的去磷酸化由丙酮酸脱氢酶磷酸酶进行以产生活性形式。抑制肿瘤细胞中PDHKs活性可有效阻断糖酵解代谢途径,同时起到激活线粒体氧化代谢、诱导细胞凋亡的作用,因此,PDHKs抑制剂的研究也成为药物研发领域的研究热点之一。本研究拟围绕丙酮酸脱氢酶激酶1（PDHK1）,基于计算机辅助设计从天然产小分子库中筛选PDHK1抑制剂,并通过体内外实验探究PDHK1抑制剂钩藤碱的抗结直肠癌分子作用机制。方法:1.PDHK1对结直肠癌转移及生存预后的影响:（1）通过分析GEO数据集对比结直肠癌转移灶与非转移灶中糖酵解及TCA循环相关蛋白水平,结直肠癌转移样本中糖酵解水平升高,且分级越高PDHK1表达越高。（2）通过分析Oncomine数据库中不同TNM分级及Dukes分级的结直肠癌中PDHK1m RNA表达水平,同时免疫组化实验检测47例结直肠癌组织样本中正常、癌旁、肿瘤灶的PDHK1表达情况。2.PDHK1抑制剂筛选及钩藤碱作用位点研究:（1）构建PDHK1药效团,利用lib Dock,CDOCKER,从抗癌天然小分子库中筛选候选化合物。（2）表面等离子共振技术测量小分子与PDHK1亲和力及结合速率,并通过CETSA、DARTs、pulldown等实验进一步验证。（3）通过构建突变位点PDHK1细胞株,验证钩藤碱与PDHK1作用位点。3.钩藤碱对结直肠癌细胞糖代谢及线粒体功能的影响:（1）MTT实验检测0、15、30、45、60μM浓度下对人结直肠癌细胞系HCT-116、SW480、SW620细胞增殖的影响,并且在0、30、60μM浓度RHY下细胞糖摄取,乳酸产量线粒体呼吸水平。（3）通过透射电镜,线粒体泛素化检测线粒体自噬的发生,ROS水平及线粒体膜电位检测实验用于评价线粒体功能变化。4.钩藤碱调节结直肠癌细胞自噬抑制转移的分子机制研究:（1）通过检测不同浓度钩藤碱以及与不同自噬抑制剂组合对自噬相关蛋白表达情况,以及自噬流的产生,评价钩藤碱对结直肠癌细胞自噬的影响。（2）通过检测不同浓度钩藤碱以及与不同自噬抑制剂组合对转移相关蛋白表达情况,结合transwell、划痕实验评价细胞迁移能力,探究钩藤碱调节结直肠癌细胞转移的机制。5体内钩藤碱抑制结直肠癌转移的活性研究:分别构建PDX、PDHK1高表达结直肠癌小鼠模型以及PDHK1高表达结直肠癌小鼠模型,验证钩藤碱药效以及对结直肠癌进展和转移的影响结论:1.结直肠癌转移灶糖酵解相关蛋白表达水平升高,PDHK1在结直肠癌肿瘤组织中表达升高,且肿瘤分级越高表达越高。2.钩藤碱与PDHK1具有良好结合能力,结合位点为Lys315。3.钩藤碱抑制结直肠癌细胞增殖及糖代谢,抑制PDHK1功能促进线粒体自噬。4.钩藤碱促进结直肠癌细胞自噬抑制转移。5.钩藤碱抑制PDX结直肠癌小鼠模型肿瘤进展,抑制Apc Min小鼠过表达PDHK1模型肿瘤进展及转移。