【摘 要】
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本论文基于大肠杆菌克隆表达体系,通过分子生物学手段对目的蛋白（赖氨酸脱羧酶和漆酶）进行高效表达,并应用于戊二胺的制备和抗生素的降解,为戊二胺的中试放大和其他有机污染物的降解提供有益参考。本论文的主要研究内容如下:（1）赖氨酸脱羧酶的高效表达及其催化合成戊二胺的工艺开发:来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的一种名为Cad A的赖氨酸脱羧酶被用来催化赖氨酸制备1,5-戊二胺。基于酶的分
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本论文基于大肠杆菌克隆表达体系,通过分子生物学手段对目的蛋白（赖氨酸脱羧酶和漆酶）进行高效表达,并应用于戊二胺的制备和抗生素的降解,为戊二胺的中试放大和其他有机污染物的降解提供有益参考。本论文的主要研究内容如下:（1）赖氨酸脱羧酶的高效表达及其催化合成戊二胺的工艺开发:来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的一种名为Cad A的赖氨酸脱羧酶被用来催化赖氨酸制备1,5-戊二胺。基于酶的分子动力学模拟,对赖氨酸脱羧酶的蛋白分子进行理性设计,并基于大肠杆菌重组菌株BL21-Pcad-Cad A,通过核糖体结合位点优化,构建了高效表达赖氨酸脱羧酶的工程菌株BL21-Pcad-Cad A-L,酶活可达14.51U/mg。通过研究不同催化方式、工艺条件对催化制备1,5-戊二胺的影响,优化生物催化剂合成戊二胺的制备工艺,获得利用破菌粗酶液制备戊二胺的最佳工艺。相对于透性化细胞法,该工艺操作更为简便,更适用于工业生产。基于此,该催化体系扩大至2 L,反应24 h,戊二胺浓度可达219 g/L,产率可达98.2%,高于透性化细胞的205 g/L戊二胺产量,可满足工业生产水平。（2）漆酶的高效表达及透性化细胞对抗生素的降解:来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一种名为Cot A-TJ102的漆酶被用来降解抗生素。基于大肠杆菌重组菌株Trans-28a-Cot A-TJ102,通过漆酶基因核糖体结合位点优化,构建了工程菌株Trans-Cot A-LRBS,漆酶酶活从3076.21 U/mg增加至5197.71 U/mg。通过对工程菌株Trans-Cot A-LRBS进行乙醇透性化处理,制备透性化细胞,细胞膜通透性的增强促进了底物和产物的质量转移。通过工艺优化,在透性化细胞的制备过程中添加5 m M Cu2+（温度:30 oC,p H:8,存储时间:12 h）,漆酶Cot A-TJ102的酶活达到最大值,为6072 U/mg。基于此,在TEMPO存在的条件下,富含Cot A-TJ102的透性化细胞对环丙沙星（CIP）,氯霉素（CAP）和四环素盐酸盐（TCH）的降解率分别为95.42%,73.11%,98.73%。同时,通过分子对接分析和液质联用检测研究了降解机理。透性化细胞降解抗生素是一种低成本,绿色,适用范围广泛的抗生素去除方法,并为其他有机污染物的降解提供了新的方法。
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