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抗肿瘤血管生成治疗较传统的治疗方式在理论上具有很多优点,如药物可以直接作用于遗传稳定的内皮细胞,避免穿过血管内皮递送药物而降低药物疗效,而且能够很大程度上改善耐药性等。但是,这种治疗方式仍然存在较多缺点,如特异性较低、全身毒副作用明显和见效慢等。目前已知的多种肿瘤血管内皮细胞标志物如CD34、CD31和VEGF等,在正常内皮细胞中也有表达,这将会降低肿瘤治疗的靶向性。因此,发现肿瘤内皮细胞特异性标记分子具有重要意义。2000年,St Croix等[1]首次在结肠癌组织中发现肿瘤内皮细胞表面标志物TEMs家族,其中TEM8在结肠癌内皮细胞中表达量较为显著,而在正常血管内皮细胞中几乎没有表达。随后相继有学者研究证实了TEM8特异性表达于肿瘤血管内皮细胞中。然而迄今为止,TEM8在临床常见实体肿瘤内皮细胞中的表达特性及其潜在意义尚不明确,TEM8是否参与肿瘤血管生成及其在肿瘤血管生成中的作用机制仍有待阐明。本研究选择人肺癌组织作为研究对象,应用免疫组织化学染色检测TEM8在58例非小细胞肺癌及癌旁组织血管内皮中的表达,进而分析肺癌间质中TEM8表达阳性的微血管计数与临床病理特征的关系;应用免疫荧光双染对肺癌间质血管进行TEM8及CD34染色进行共定位分析。为进一步明确TEM8在肿瘤内皮细胞中的特异性表达及其在肿瘤血管生成中的可能作用机制,选用肿瘤内皮细胞2H11进行体外细胞学实验,以人脐静脉内皮细胞HUVEC作为对照,应用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western Blot和RT-PCR等方法检测TEM8在肿瘤内皮细胞中的表达;进而通过IL-1β处理2H11细胞,Western-Blot及RT-PCR检测wnt信号通路相关分子,旨在初步探究TEM8通过激活wnt信号通路促进肿瘤内皮细胞增殖的分子机制;通过CCK-8实验检测IL-1β刺激前后2H11细胞的增殖能力,划痕实验观察细胞的迁移能力。结果如下:一、TEM8在NSCLC组织中的表达及其与临床病理特征的关系1.免疫组化结果显示,TEM8主要定位于肺癌间质血管内皮细胞的细胞浆和(或)细胞膜,可沿微血管管腔完整分布或散在分布。TEM8在NSCLC患者癌组织中表达的阳性率为96.56%(56/58),癌旁组织中的阳性率为20.69%(12/58),二者比较具有显著性差异(P<0.05),说明TEM8在肺癌间质血管内皮中特异性表达。2.对肺癌间质中TEM8阳性表达区域进行微血管计数,分析TEM8阳性微血管密度与NSCLC患者临床病理特征的关系。结果显示,临床分期晚期患者TEM8微血管密度显著高于早期患者(P=0.0011);发生淋巴结转移患者TEM8微血管密度显著高于无淋巴结转移者(P<0.0001);而与患者年龄、患者性别、肿瘤大小以及肿瘤分化程度等无显著相关性(P>0.05)。3.根据TEM8染色判定标准统计TEM8在肺癌间质中的阳性细胞比例和染色强度进行半定量分析。应用CD34标记肿瘤血管,计数MVD值,分析TEM8与CD34表达的相关性。结果显示,TEM8高表达的NSCLC患者肿瘤组织中CD34阳性MVD值显著高于TEM8低表达NSCLC患者的MVD值,二者比较具有统计学意义(P<0.05)。4.应用免疫荧光双染对肺癌间质血管中TEM8及CD34的表达进行定位分析。结果显示,在肺癌间质中TEM8与CD34标记血管存在共定位,也可以分别表达于不同的血管内皮。二、TEM8在肿瘤内皮细胞中的特异性表达及其参与肿瘤血管生成的可能机制1.应用肿瘤内皮细胞2H11进行体外细胞学实验,以人脐静脉内皮细胞HUVEC作为对照,分别从蛋白和m RNA水平检测TEM8在肿瘤内皮细胞中的表达。细胞免疫荧光、流式细胞术、Western Blot和RT-PCR等结果均显示TEM8特异性表达于肿瘤内皮细胞,而在正常内皮细胞中呈阴性或弱表达。2.应用IL-1β处理2H11细胞,Western Blot、RT-PCR等方法检测wnt信号通路相关分子,β-catenin、磷酸化β-catenin、Axin-2和Cyclin D1等分子的表达。结果显示,IL-1β刺激2H11细胞以10ng/m L,2h时TEM8表达量最高。IL-1β处理后,TEM8在蛋白和RNA水平的表达均有上调,且wnt信号通路相关分子,β-catenin、Axin-2和Cyclin D1在蛋白和RNA水平表达明显增加,磷酸化β-catenin蛋白水平明显减少(P<0.05),表明wnt信号通路活性增强。3.CCK-8细胞增殖实验和划痕实验结果显示,10ng/m L IL-1β处理2H11细胞6h、12h后,TEM8表达上调可促进TECs增殖;10ng/m L的IL-1β处理24h后细胞迁移速率明显增加(P<0.01),表明TEM8表达上调可促进TECs迁移。通过上述实验得出如下结论,TEM8特异性表达于肺癌间质血管内皮细胞,其表达与肺癌的淋巴结转移和临床病理分期密切相关;TEM8表达高的肺癌组织CD34阳性微血管密度显著高于TEM8表达低的肺癌组织;TEM8可能通过激活wnt-β-catenin信号通路促进肿瘤内皮细胞增殖、迁移和血管生成。上述问题的阐明为将TEM8作为肿瘤血管特异性标志物及以TEM8为靶点的特异性肿瘤治疗提供实验依据,也为以TEM8为切入点研究肿瘤血管生成机制提供新思路。