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目的:山慈菇酯提物(Cremastra appendiculata,Cr Ap)体内外抗4T1乳腺癌的作用以及对4T1乳腺癌荷瘤小鼠免疫相关机制的研究。方法:1.采用MTT法检测不同浓度(12500ug/m L、1250ug/m L、125ug/m L、12.5ug/m L、1.25ug/m L、0.125ug/m L)的Cr Ap在24h、48h、72h对4T1乳腺癌细胞的增殖抑制作用。2.100只BABL/c雌性小鼠植瘤,植瘤成功后,随机分成5组:空白对照组、模型组、阿霉素(Adriamycin,ADM)阳性对照组、Cr Ap组以及Cr Ap+ADM组,每组各20只。Cr Ap组以96mg/kg给药,每日1次,阳性对照组以2mg/kg ADM给药,隔日1次,Cr Ap+ADM组给予相同剂量的Cr Ap和ADM,其余组给予生理盐水,每日1次,均腹腔注射,连续给药21天。每7天小鼠进行称重,绘制体重曲线;每3天测量小鼠肿瘤长径及短径,绘制肿瘤曲线;剥离癌组织,计算抑瘤率;取部分癌组织做HE染色;剥离胸腺和脾,计算胸腺和脾系数;取部分胸腺和脾做HE染色;取外周血于抗凝管中,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测CD4~+T、CD8~+T、调节性T细胞(Regulatory Cell,Tregs)、B淋巴细胞(B-lymphocyte,B)分类以及CD4~+/CD8~+比值的变化;剩余脾和癌组织制备组织悬液,ELISA法检测白介素-2(Interleukin-2,IL-2)、肿瘤坏死因子-ɑ(Tumor necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和白介素-10(Interleukin-10,IL-10)含量的变化。结果:1.在MTT实验中,不同浓度的Cr Ap抑制率范围为13.48%～74.47%,其中Cr Ap(125μg/m L)在72h抑制作用最强,抑制率为74.47%。2.1体重曲线:模型组较空白组体重明显降低(P<0.01);同时ADM组和Cr Ap+ADM组较模型组体重明显降低(P<0.01),但Cr Ap组体重明显增加(P<0.01);另外,Cr Ap组和Cr Ap+ADM组较ADM组体重均明显增加(P<0.01)。2.2肿瘤曲线:各药物组较模型组肿瘤体积均明显减小(P<0.01)。2.3抑瘤率:各药物组对荷瘤小鼠肿瘤均有抑制作用,其中Cr Ap+ADM组抑瘤率为53.67%,抑制作用最强。2.4癌组织HE染色:模型组肿瘤细胞形态完好,数目较多,坏死区域少见;Cr Ap以及Cr Ap+ADM组肿瘤细胞出现胞浆破裂以及胞核溶解,密度降低,并存在不同程度死亡区域。2.5免疫器官脏器系数:模型组较空白组胸腺系数减小(P<0.05),脾系数明显增加(P<0.01);与模型组相比,Cr Ap组胸腺系数无统计学意义(P>0.05),但脾系数明显增加(P<0.01);同时与ADM组相比,Cr Ap组胸腺系数明显增加(P<0.01),Cr Ap组和Cr Ap+ADM组脾系数均明显增加(P<0.01)。2.6免疫器官HE染色:胸腺病理图显示,模型组较空白组胸腺淋巴细胞数量减少,皮质髓质分界较模糊;Cr Ap组较模型组胸腺淋巴细胞数量增多,皮质与髓质存在较明显分界;Cr Ap+ADM组较模型组胸腺有一定程度的改善。脾脏病理图显示,模型组较空白组白髓与红髓边缘分界不清,淋巴细胞及巨噬细胞含量较少;Cr Ap组较模型组红白髓交界相对清楚,淋巴细胞及巨噬细胞含量增多,Cr Ap+ADM组变化较ADM组强,但不及Cr Ap组。2.7 FCM结果:模型组较空白组CD4~+T、CD19~+B表达和CD4~+/CD8~+比值明显降低(P<0.01),CD8~+T表达降低(P<0.05),而CD4~+CD25~+Tregs表达明显升高(P<0.01);但与模型组相比,各药物组CD4~+T表达明显升高(P<0.01),而CD4~+CD25~+Tregs表达明显降低(P<0.01),ADM组和Cr Ap+ADM组CD8~+T表达明显升高(P<0.01),Cr Ap组和Cr Ap+ADM组CD4~+/CD8~+比值及CD19~+B表达均明显升高(P<0.01);另外,与ADM组相比,Cr Ap+ADM组CD4~+T表达明显升高(P<0.01),Cr Ap组和Cr Ap+ADM组CD4~+/CD8~+比值以及CD19~+B表达均明显升高(P<0.01)。2.8 ELISA结果:在脾组织中,模型组较空白组IL-2、TNF-α、IFN-γ含量明显降低P<0.01),IL-10含量明显升高(P<0.01);但与模型组相比,各药物组IL-2和TNF-α含量明显升高(P<0.01),IL-10含量明显降低(P<0.01),同时Cr Ap组IFN-γ含量明显升高(P<0.01);在癌组织中,与模型组相比,各药物组IL-2含量均明显升高(P<0.01),而TNF-α含量明显降低(P<0.01),Cr Ap组和Cr Ap+ADM组IFN-γ含量明显升高(P<0.01),而IL-10含量明显降低(P<0.01)。另外,与ADM组相比,Cr Ap组明显升高脾组织中IFN-γ含量(P<0.01),Cr Ap+ADM组升高脾组织中IL-2含量(P<0.05),以及Cr Ap组明显降低癌组织中TNF-α含量(P<0.01),Cr Ap组和Cr Ap+ADM组明显升高癌组织中IFN-γ含量(P<0.01)。结论:在体外,Cr Ap可抑制4T1乳腺癌细胞的增殖;在体内,Cr Ap能抑制4T1乳腺癌的增长。Cr Ap抗TNBC乳腺癌的机制可能是通过调节肿瘤微环境以及全身的免疫功能来实现的。此外,在Cr Ap和ADM联合用药中,Cr Ap可以增强ADM抗4T1乳腺癌及免疫调节作用。