实蝇是一类重要的检疫性园艺害虫,目前防治实蝇的主要方法依赖于化学防治和成虫诱杀。化学防治见效快,但易出现农药污染、害虫抗药性等问题。因此利用引诱剂引诱成虫是实蝇绿色防治的重要手段。本研究通过采集果园虫果及寄主叶片等环境酵母菌,通过生物测定筛选对南亚果实蝇Zeugodacus tau、橘小实蝇Bactrocera dorsalis具有高效引诱活性的菌株,并研究其发酵技术和剂型,为实蝇绿色防控提供资源和技术基础。主要研究结果如下:1.酵母菌菌株的采集、分离鉴定从海南、广东、广西、江西、浙江、湖北等实蝇发生为害较普遍的南方地区果园采集南亚果实蝇、橘小实蝇为害的虫果及寄主叶片,分离并鉴定样品中的酵母菌,共获得357株酵母菌菌株。通过26S r DNA测序,鉴定这些菌株分属于8个属和25个种,分别是6种假丝酵母Candida、5种有孢汉逊酵母Hanseniaspora、9种毕赤酵母Pichia、1种酿酒酵母Saccharomyces、1种有孢圆酵母Torulaspora、2种Galactomyces属酵母、1种Starmerella属酵母和1种Wickerhamomyces属酵母,为后续实验提供菌种资源。在所有采集到的酵母菌中,优势种是仙人掌有孢汉逊酵母Hanseniaspora opuntiae,优势度指数为0.22;其次为库德里阿兹氏毕赤酵母Pichia kudriavzevii,优势度指数0.21。其中虫果分离的酵母菌优势种是P.kudriavzevii,优势度指数为0.29;其次为H.opuntiae,优势度指数0.17;叶片分离的酵母菌优势种是H.opuntiae,优势度指数为0.30;其次为P.kluyveri,优势度指数0.18。2.对实蝇高效引诱活性菌株的筛选在模拟田间环境的半封闭网室中测定本研究采集获得的357株酵母菌株和本实验室保存的、来自橘小实蝇幼虫肠道内的200株酵母菌株对南亚果实蝇和橘小实蝇雌雄成虫的引诱活性,获得16株引诱活性较好的菌株,分别是球形环孢菌Torulaspora globosa HBMTA13、德尔布有孢圆酵母Torulaspora delbrueckii GDMGA11、山田氏酵母属Yamadazyma sp.HIYTA36、库德里阿兹氏毕赤酵母P.kudriavzevii GXYTA26、仙人掌有孢汉逊酵母H.opuntiae GXGJA43、克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri ZJGJA31、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri ZJGJA03、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri YNYTA15、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri ZJGJA08、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri ZJGJA09、库德里阿兹氏毕赤酵母P.kudriavzevii GXYTA19、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri GXGJA42、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri ZJGJA07、仙人掌有孢汉逊酵母H.opuntiae GXGJA01、克鲁维毕赤酵母P.kluyveri ZJGJA01和克鲁维毕赤酵母P.kluyveri ZJGJA04。其中引诱活性最高的菌株为球形环孢菌T.globosa HBMTA13,分离自橘小实蝇为害的毛桃果实。该菌株在网室中对南亚果实蝇、橘小实蝇引诱数量分别为20.20±1.11头/诱捕器和24.20±0.80头/诱捕器,显著高于其他15株菌株对南亚果实蝇引诱数量（1.93±0.54至11.00±3.72头/诱捕器）和对橘小实蝇引诱数量（4.64±1.33至12.57±2.48头/诱捕器）。我们以此菌株开展后续发酵技术和引诱剂研究。3.高引诱活性酵母菌T.globose HBMTA13的发酵技术研究通过单因素实验初步筛选高引诱活性酵母菌T.globosa HBMTA13培养基中碳源、氮源和微量元素的组成,并研究温度、p H值、装液量和接种量等培养条件对菌株生长的影响,以及所用氮源、碳源对该菌株发酵产物酶解蛋白活性的影响。结果表明以玉米淀粉糖化产物（3.75±0.04 g/L）和木薯淀粉糖化产物（3.69±0.04 g/L）为碳源的培养基发酵干物质产量显著高于YPD（2.81±0.06 g/L）、马铃薯淀粉糖化产物（2.77±0.03 g/L）,考虑到成本问题,我们选择成本更低的玉米淀粉进行后续实验。玉米淀粉糖化产物培养基的酵母酶解蛋白对南亚果实蝇（39.67±8.62头/诱捕器）和橘小实蝇（44.67±9.45头/诱捕器）的引诱活性与常见YPD培养基的（38.00±2.65头/诱捕器和46.00±12.53头/诱捕器）相比,无显著差异。因此选用玉米淀粉糖化产物作为T.globosa HBMTA13发酵培养基的碳源。以血粉（blood＿ash）或鱼粉（fish＿ash）作为氮源的培养基干物质产量最高,其产量分别为6.76±1.82 g/L和6.36±0.94 g/L,显著高于其他氮源处理的培养基,其次是多价蛋白胨为氮源的YDP培养基（2.96±0.03 g/L）。但是以血粉作为氮源的培养基,其酵母酶解蛋白对南亚果实蝇（33.67±6.35头/诱捕器）和橘小实蝇（26.00±6.08头/诱捕器）的引诱活性显著低于多价蛋白胨（47.67±10.69头/诱捕器和43.33±11.06头/诱捕器）;以鱼粉作为氮源的培养基,其酵母酶解蛋白对南亚果实蝇（30.00±7.00头/诱捕器）和橘小实蝇（31.33±9.81头/诱捕器）的引诱活性显著低于多价蛋白胨（54.33±2.89头/诱捕器和51.00±5.29头/诱捕器）。因此,为保证酵母酶解蛋白的引诱活性,我们选用多价蛋白胨作为发酵培养基的氮源。在微量元素单因素实验中,YPD+KCl（3.25±0.29 g/L）、YPD+Ca Cl2（3.19±0.06g/L）、YPD+Mg Cl2（3.08±0.05 g/L）、YPD+KH2PO4（2.89±0.01 g/L）培养基的干物质产量都显著高于YPD培养基（2.38±0.08 g/L）,但添加微量元素处理之间的干物质产量之间无显著差异。我们采用产量最好且成本较低的KCl作为微量元素添加到培养基中。分别测定T.globosa HBMTA13在24℃、27℃、30℃、33℃、36℃等不同温度下的发酵干物质产量后,发现在温度为27℃时该菌株干物质产量（3.14±0.02g/L）最高,显著高于其他温度。其次是发酵温度为24℃时（2.84±0.07 g/L）。我们采用27℃作为T.globosa HBMTA13的发酵温度。pH值为5的时干物质产量最高,为3.01±0.06 g/L,显著高于p H值为3、9、11时的产量。其次是p H值为7时（2.95±0.07 g/L）。因此我们在发酵时,将培养基的p H值调整为5。在装液量筛选实验中,50 m L、100 m L和150 m L装液量干物质产量分别为2.80±0.03 g/L,2.71±0.14 g/L和2.42±0.05 g/L。50 m L装液量干物质产量显著高于150 m L装液量,但与100 m L装液量干物质产量没有显著差异。考虑到产量出现随着装液量较低而升高的趋势,因此在正交实验中以50 m L装液量为基础,进一步研究最佳装液量。在接种量筛选实验中,4种接种量的干物质产量两两之间无显著差异。5%、7%、9%、11%接种量产量分别为3.69±0.12 g/L、3.68±0.03 g/L、3.63±0.02 g/L、3.56±0.07 g/L。因此我们在发酵时选择5%接种量,以减少成本。确定各项单因素最佳选择后,通过正交实验进一步优化培养技术,最终结果显示该菌株最佳发酵培养基配方为:每100 m L培养基中以浓度为6%糖分的玉米淀粉糖化产物为碳源,1%多价蛋白胨作为氮源,添加0.05 mol/L KCl和0.5%酵母提取物,p H值为5;发酵条件为培养温度27℃,250 m L锥形瓶中装液量为30 m L。与常规YPD培养基发酵相比,该发酵技术可以在相同发酵时间内,将发酵产物产量由3.13 g/L显著提高到7.73 g/L,并且干物质成本也从1.28元/g降低至0.45元/g。4.基于酵母菌T.globose HBMTA13的实蝇引诱剂研制通过比较T.globose HBMTA13发酵液不同组分对南亚果实蝇的引诱活性,发现发酵液（2.83±0.56）、上清液（2.20±0.52）、酵母酶解蛋白（2.54±0.26）三者的室内引诱指数无显著差异,但显著高于阴性对照（1.00±0.00）以及菌体（0.06±0.02）和空白对照（0.09±0.04）。上述成分对橘小实蝇的引诱活性测定结果表明,发酵液（2.01±0.36）、上清液（2.50±0.72）、酵母酶解蛋白（2.51±0.29）三者的室内引诱指数无显著差异;但显著高于阴性对照（1.00±0.00）以及菌体（0.09±0.04）和空白对照（0.05±0.02）。考虑到实际应用的可操作性,我们选择固形物含量较高的酵母酶解蛋白溶液作为引诱剂的活性成分进行后续研究。为了延长酵母酶解蛋白溶液的持效期,我们研究了双乙酸钠与山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯和丙酸钙3种防腐剂组合的防腐效果,结果表明添加0.80%双乙酸钠和0.20%对羟基苯甲酸甲酯可以在30 d内有效防止腐坏,可以作为引诱剂的防腐剂成分。将酶解蛋白溶液通过喷雾干燥塔干燥后,参考前人片剂配方设计并筛选出一种片剂基础配方,通过正交实验进一步优化片剂配方,研制获得一种基于酵母菌T.globose HBMTA13的实蝇引诱剂（片剂）:0.50 g酵母酶解蛋白粉、0.20 g微晶纤维素、0.14 g羧甲基淀粉钠、0.04 g交联聚维酮、0.40 g柠檬酸、0.20 g碳酸氢钠、0.80 g双乙酸钠和0.20 g对羟基苯甲酸甲酯混匀,用压片机于20 k N压力压制成片剂。该片剂可以经受3 m高度自由落体的冲击,强度较高;在100 m L水中溶解时间为14 min,溶解较快;使用自动压片机连续制作时不易出现黏冲、松片等现象,达到片剂生产工艺标准。室内引诱活性测定表明该片剂对南亚果实蝇（74.00±4.15头/诱捕器）和橘小实蝇（30.80±6.35头/诱捕器）的引诱活性与目前检疫部门常用的进口商品圆酵母引诱剂（72.80±1.50头/诱捕器和35.20±3.41头/诱捕器）的引诱活性无显著差异;野外实验中,该片剂对南亚果实蝇的引诱活性（63.33±8.82头/诱捕器）与商品圆酵母引诱剂（45.67±17.85头/诱捕器）也无显著差异。同时本研究研制的片剂原料成本仅0.39元/片,相比于进口商品圆酵母引诱剂3.00元/片,降低了87%左右。因此本研究研制出的实蝇引诱剂引诱效果好,成本低廉,具有广泛的应用前景。