水稻是世界主要粮食作物，而病虫害是影响其产量的主要因素之一。近年来，转基因抗虫水稻有效地解决了常规育种迄今未能攻克的抗虫问题，然而其在国内乃至世界范围内尚未得以大面积商业化种植。转基因粮食作物的生物安全性尤其是其食用安全性长期以来一直是公众关注的焦点。因此，如何培育种子中完全不表达外源蛋白的“绿色”抗虫水稻新品种，已成为当前转基因领域亟需解决的一个重要课题。　　本研究利用水稻绿色组织特异性表达启动子rbcS及位点特异性重组系统Cre/lox，研制一个“基因开关”系统，由基因锁(LOCK)和基因钥匙(KEY)组成。首先利用Nos终止子及两个同向的loxP位点开发的基因锁LNL（loxP∷NosT∷loxP），在所有组织中锁定目的基因的表达;然后在需要目的基因表达的组织中，如害虫危害的茎、叶等组织，利用rbcS绿色组织特异表达启动子、KRP2核定位信号肽和Cre重组酶等元件开发的基因钥匙，可以有效地切除基因锁LNL中的Nos终止子，从而开启目的基因的表达以获得期望的功能。而在非绿色组织中由于缺少基因钥匙的表达，使得目标基因保持锁定状态完全不表达外源蛋白。同时，利用上述“基因开关”系统与抗虫基因Cry1Ab/1Ac及Vip3ArLr1，培育在后代种子中零表达外源蛋白而在叶片和茎秆中表达适量丰度抗虫蛋白的“绿色”抗虫水稻。本文主要研究结果显示:　　(1)“基因开关”系统的研制及验证。该系统由基因锁和基因钥匙组成，利用报告基因eYFP验证其功能。首先，分别构建用于验证基因开关的基因锁和基因钥匙的表达载体pSB130-Actin1∷loxP∷NosT∷eYFP∷NosT（简称pLY）和pSB130-PrbcS∷Krp2∷Cre∷NosT(简称pKEY)。瞬时表达研究结果显示，通过基因枪转化技术将验证型质粒先后累加到未经再生的非绿色愈伤组织中，由于基因钥匙不表达，基因锁中被Nos终止子锁定的eYFP基因不能开锁而不发出黄色荧光;换用再生的绿色愈伤组织做同样的处理，由于基因钥匙表达，基因锁中Nos终止子被删除，锁定的eYFP基因可以开锁和表达，发出黄色荧光。该结果初步验证所研制的基因开关系统具有可行性。在此基础上，获取两者永久转化日本晴的LY和KEY转化系，杂交后检测其杂交F1代LY/KEY组合材料中eYFP蛋白的荧光信号，叶片中可检测到黄色荧光，根和F3代种子（两个基因均纯合）中均检测不到黄色荧光。进一步验证所研制的基因开关系统可以按照预期工作。　　(2)“基因开关”系统基因钥匙和报告基因表达模式分析。利用半定量PCR和实时荧光定量PCR技术分析了前述LY/KEY杂交F1材料中Cre和eYFP基因的转录本表达情况，结果显示:这两个基因均在叶片、叶鞘、茎秆及幼嫩的颖壳等绿色组织中表达，在叶片中的表达量最高;在根、花药和去除颖壳的种子等非绿色组织中不表达。　　(3)利用“基因开关”系统培育胚乳零表达型“绿色”抗虫水稻。首先，将验证型基因锁质粒中的报告基因替换成Bt抗虫基因（简称pLB），并用配套的pKEY和pLB应用型质粒分别转化日本晴材料以获得相应的KEY和LB转化系，通过Southern杂交分析和筛选其中单拷贝的转化系各3个，然后将KEY与LB进行成对正交和部分反交，共获得12个LB/KEY和KEY/LB杂种F1。其次，2014年种植上述所有的杂种F1、KEY和LB转化系亲本、野生型日本晴阴性对照和T51-1及其衍生的两系抗虫杂交稻浙优3号阳性对照，并分别于分蘖、抽穗和灌浆三个时期系统地检测其叶片、茎秆以及完熟期糙米和精米中Cry1Ab蛋白的含量。结果显示:不同LB/KEY和KEY/LB杂种F1叶片中的Cry1Ab蛋白含量出现较大的变化，最低为0.42μg/g，最高为4.68μg/g，其平均值与阳性对照T51-1叶片中的2.11μg/g大体相当，但比浙优3号叶片中的1.30μg/g明显要高;同样的，不同LB/KEY和KEY/LB杂种F1茎秆中的Cry1Ab蛋白含量也出现较大的变化，范围从0.07μg/g到1.10μg/g，其平均值却比阳性对照T51-1明显要低，但部分杂交组合与浙优3号相当。再次，挑选叶片和茎秆中Cry1Ab蛋白含量较低的LB3/KEY1、LB7/KEY1和LB9/KEY1等3个组合在大田进行人工接虫二化螟处理，每株接种1个卵块的1龄幼虫虫量，以野生型日本晴为对照。结果显示:3个杂交组合受二化螟的危害率仅为6.40-7.64％，与对照的30.15％存在极显著差异;在自然发虫条件下，杂种F1材料几乎未见二化螟和卷叶螟危害，而野生型日本晴对照受二化螟危害造成的危害率达7.59％、受稻纵卷叶螟危害的分蘖比率甚至高达63.82％，初步表明 LB/KEY和KEY/LB杂交组合具有良好的抗螟虫性能。最后，检测LB/KEY和KEY/LB杂种F1收获的F2种子中糙米和精米的Cry1Ab蛋白含量，精米的检测值均与野生型日本晴阴性对照无显著差异，糙米中只有部分组合略高于阴性对照。而T51-1和浙优3号阳性对照的检测值(糙米和精米检测值分别高达0.88μg/g、0.40μg/g及0.37μg/g、0.16μg/g)。最后，主要农艺性状的考察结果显示部分杂交组合与原品种对照无显著差异。至此，培育胚乳零表达“绿色”抗虫水稻的目的已达到。　　(4)“绿色”抗虫水稻新品种不同年份重复测验。2015年，从前述12个杂种F1中选择叶片及茎秆中Cry1Ab/1Ac蛋白含量较高的LB3/KEY2、LB7/KEY2及 KEY2/LB3，表达量中等的LB3/KEY1、LB7/KEY1及KEY1/LB3，新增含量偏低的LB1/KEY1和LB1/KEY2等8个杂交组合进行重复测定。结果表明:杂交组合LB3/KEY2、LB7/KEY2及KEY2/LB3在叶片及茎秆中的Cry1Ab蛋白含量检测值与2014的结果高度重演，且其田间抗螟虫的性能表现非常稳定。进一步选择叶片及茎秆中Cry1Ab蛋白测定值最高的LB3/KEY2组合进行人工接虫二化螟处理，结果显示二化螟造成的危害率仅仅只0.78％，与对照高达56.26％的危害率呈极显著差异。最后，8个杂种F1收获的F2种子中同样几乎检测不到抗虫蛋白。因此，进一步证实胚乳零表达“绿色”抗虫水稻完全符合预期的目标。为消除公众对转基因粮食作物食用安全性的担忧提供了技术基础。　　(5)胚乳零表达“绿色”抗虫杂交水稻的培育。在培育上述日本晴背景“绿色”抗虫水稻的同时，利用两系杂交稻亲本开展了应用研究。光温敏雄性不育系604S和017S主要转化基因钥匙质粒pKEY，恢复系MH63和ZR6则主要转化基因锁质粒 pLB。同时，考虑到常规稻的选育与应用，恢复系MH63同时转化了钥匙质粒pKEY。转化后，各受体品种都获得了2个或以上的独立转化系。经southern杂交分析从中筛选稳定表达的单拷贝或多拷贝转化株或系，用于两系杂交稻的配组，其获得的阳性杂种F1经Cry1Ab/1Ac快速检测试纸检测发现叶片均能正常表达Cry1Ab/1Ac蛋白，且经自然感虫鉴定证实均具有良好的抗二化螟和稻纵卷叶螟的性能。　　(6)“基因开关”系统控制两种抗性基因聚合研究。考虑到一把基因钥匙能否同时有效地开启两个被锁定的目标基因表达，特用本课题组改良的新型杀虫蛋白基因Vip3Ar1L1替换最初pLB基因锁质粒中Cry1Ab/1Ac基因，产生了新的抗虫基因锁pLV质粒，并经遗传转化获得10个以上日本晴背景的LV转化系。然后，通过有性杂交将这两种转化系中的Vip3Ar1L1和Cry1Ab/1Ac聚合，再用KEY转化系与之杂交配组，获得相应的杂种F1组合LBLV/KEY和KEY/LBLV。应用Cry1Ab/1Ac和Vip3A快速检测试纸检测显示，杂种F1绿色组织叶片中同时有Bt和VIP蛋白表达，而在其非绿色的根的检测显示阴性。因此，所设计的基因钥匙KEY确实能同时有效地开启两个被锁定的目的基因的表达，这对增强基因开关系统的性能和拓展其应用范围具有重要的实际意义。