论文部分内容阅读
真菌物种白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans)是一种机会性病原体,可导致人类严重感染,特别是在免疫功能低下的患者和各种生物材料的体内植入中,其极易形成生物膜粘附在植入体表面。最近,白色念珠菌生物膜相关感染对公众健康构成越来越大的威胁,传统药物治疗效果不佳且副作用大,迫切需要对白色念珠菌生物膜感染实现有效且针对性的治疗。本研究旨在制备适配体AD1修饰的载两性霉素B(Amphotericin B,AmB)的聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚乙二醇(Poly(lactic-co-glycolic acid)-Polyethylene glycol,PLGA-PEG)纳米粒(Aptamer AD1 modified amphotericin B-loaded PLGA-PEG nanoparticles,AD1-AmB-NPs),增强其对白色念珠菌壁上1,3-β葡聚糖的识别能力,并结合低频低强度超声的辐射力和声流作用等进行控释,协同促进药物向生物膜深层渗透,探索一种新型的抗真菌生物膜感染策略。目的探讨低频低强度超声联合AD1-AmB-NPs对白色念珠菌生物膜的体内外协同抗菌效果,有望为临床真菌感染治疗提供新思路。方法1.适配体AD1修饰载AmB PLGA-PEG纳米粒(AD1-AmB-NPs)的制备及特性检测:采用双乳化法制备载AmB PLGA-PEG纳米粒(Amphotericin B-loaded PLGA-PEG nanoparticles,AmB-NPs),使用碳二亚胺法将适配体AD1修饰在纳米粒表面(AD1-AmB-NPs),使用核磁共振氢谱(proton nuclear magnetic resonance,~1H-NMR)验证适配体是否修饰成功,利用马尔文激光粒度仪检测纳米粒的粒径、Zeta电位及分散性,电镜下观察纳米粒形态,聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测适配体修饰纳米粒对血清核酸酶的抵抗性,紫外分光光度法测量载药纳米粒的药物自然累积释放率及一定超声辐照后的累积释放率,并分别通过XTT法及血液生化分析比较AmB-NPs、AD1-AmB-NPs与游离药物AmB对正常细胞的毒性及动物体内药物毒副作用。2.适配体修饰纳米粒体外靶向能力检测:通过流式细胞仪定量检测不同载荧光染料DiI纳米粒(DiI-loaded PLGA-PEG nanoparticles/Aptamer AD1 modified DiI-loaded PLGA-PEG nanoparticles,DiI-NPs/AD1-DiI-NPs)与浮游白色念珠菌、耻垢分枝杆菌和大肠杆菌的连接率,通过激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscopy,LSCM)定性检测两种纳米粒与白色念珠菌及生物膜、耻垢分枝杆菌和大肠杆菌的连接情况。3.超声联合AD1-AmB-NPs对体外白色念珠菌及生物膜的杀菌作用:实验使用超声设备(42 kHz固定频率)输出声强为0--0.60 W/cm~2连续可调,后续实验参数选用声强0.30 W/cm~2,辐照时间15min。用平板计数法、XTT法和LSCM观察探究超声联合AD1-AmB-NPs对体外白色念珠菌及生物膜影响。为探究该方法作用机制,通过LSCM分析非靶向/靶向纳米粒经超声辐照后在生物膜中的渗透程度。4.超声联合AD1-AmB-NPs协同治疗体内白色念珠菌生物膜感染:建立BALB/c小鼠皮下白色念珠菌生物膜感染模型,通过真菌负荷量测定、LSCM及病理切片观察鉴定模型是否建立成功。再通过小动物活体荧光成像及LSCM鉴定适配体修饰纳米粒的体内靶向性。分组治疗感染小鼠7天,通过真菌负荷量测定及病理切片评估超声联合AD1-AmB-NPs对小鼠感染模型的局部协同抗真菌作用。结果1.AD1-AmB-NPs基本理化性质表征:(1)~1H-NMR证实适配体AD1与PLGA-PEG纳米粒成功结合。(2)AD1-AmB-NPs扫描电镜下呈规则球形,粒径均一且分散性良好,粒径为273.9±1.1 nm,表面显示低于-20 mV的负电位,透射电镜下见药物被包载在纳米粒内部,并计算出载药率为5.3%,包封率为83%。(3)适配体修饰纳米粒对血清核酸酶具有一定抵抗性,即在小鼠血清中孵育72 h后适配体仍未被降解。(4)98 h内连续监测纳米粒药物累积释放,结果显示超声能促进纳米粒药物释放,48h后其释放量约为自然释放的2倍,且AD1-AmB-NPs与AmB-NPs释放情况大体一致,纳米粒表面修饰适配体并未影响药物释放。(5)巨噬细胞与游离AmB共孵育24 h后,活性较对照组明显下降至72%(P<0.01)。然而在AmB含量相同浓度下,空NPs、AmB-NPs、AD1-AmB-NPs组巨噬细胞活性与对照组相比无显著降低(P>0.05)。(6)用AmB-NPs和AD1-AmB-NPs处理的正常小鼠诱导的BUN和SCr水平与游离AmB组相比显著降低(P<0.05),与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。2.适配体修饰纳米粒体外靶向能力评价:(1)流式结果表明,随着共培养时间的延长,AD1-DiI-NPs与白色念珠菌的结合率不断增加至87%,但与耻垢分枝杆菌/大肠杆菌结合率始终<10%。(2)LSCM观察显示AD1-DiI-NPs紧紧黏附在白色念珠菌及生物膜上,与DiI-NPs组形成鲜明对比(无纳米粒粘附),且对耻垢分枝杆菌/大肠杆菌无靶向作用。(3)通过软件定量分析AD1-DiI-NPs靶向生物膜能力,结果显示靶向纳米粒组结合力远远高于非靶向组(P<0.05)。3.超声联合AD1-AmB-NPs对体外白色念珠菌及生物膜的杀菌作用:(1)平板菌落计数显示超声联合AD1-AmB-NPs作用浮游白色念珠菌后,菌存活率与对照组相比下降至37.17%(P<0.01),LSCM观察到活细胞数(绿色荧光)明显减少,死细胞数(红色荧光)显著增加。(2)XXT法结果显示生物膜经超声联合AD1-AmB-NPs作用后,与对照组相比,生物膜活性下降62%(P<0.01),同时LSCM观察到生物膜细胞外基质减少,结构疏松,生物膜内大量死菌(红色荧光)残留。(3)通过LSCM观察不同处理后的生物膜三维重建结构图像,结果显示在非靶向组生物膜的表/中/底层几乎没有残留纳米颗粒,在靶向组生物膜表面上有大量纳米颗粒,尤其是在超声辐照后,生物膜内层中纳米颗粒量显著增加(P<0.05)。4.超声联合AD1-AmB-NPs协同治疗体内白色念珠菌生物膜感染:(1)BALB/c小鼠皮下局部注射生物膜悬浮液24 h后,在感染组织部位形成生物膜结构,且其他脏器无感染,成功建立小鼠皮下白色念珠菌生物膜感染模型。(2)小动物活体荧光成像及LSCM观察显示适配体修饰纳米粒在体内仍具有高效特异性,能靶向白色念珠菌生物膜感染部位,且在注射纳米粒制剂后24 h达到峰值。(3)感染小鼠经超声联合AD1-AmB-NPs治疗后,感染部位隆肿逐渐消失,感染组织中真菌集落形成单位与对照组相比显著减少(P<0.05),感染组织病理切片观察下显示正常的皮下组织,没有炎性细胞和真菌集落聚集,真菌感染情况明显得到改善。结论本研究成功制备了适配体AD1修饰载两性霉素B PLGA-PEG纳米粒,证实了低频低强度超声联合适配体AD1修饰载两性霉素B PLGA-PEG纳米粒在体内外对白色念珠菌生物膜均具有协同抗菌作用,以及靶向抗菌策略的可行性。