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研究目的初步揭示肝脏I/R过程中线粒体和脂质成分的动态变化,研究UDCA-LPE对肝脏I/R的保护作用及其机制,为肝脏I/R的防治提供新的治疗方向。研究方法1.构建体内体外肝缺血再灌注模型,构建体外肝细胞氧化应激模型。2.通过MDA、SOD、GSH试剂盒,ROS荧光探针、线粒体ROS探针,氧化还原信号通路分子水平检测等方法分析UDCA-LPE预处理对肝I/R过程中氧化应激水平的影响。3.通过电镜,ATP,mt DNA,线粒体膜电势,线粒体介导的凋亡信号通路分子水平检测,免疫荧光,线粒体动态信号通路分子水平检测等方法分析UDCA-LPE预处理对肝I/R过程中的线粒体功能状态的影响。4.通过色谱-质谱联用分析UDCA-LPE预处理对肝I/R过程中脂质成分动态变化的影响。5.通过WB,PCR,酶活性试剂盒,免疫荧光等方法分析在UDCA-LPE预处理对肝I/R过程中的cPLA2含量活性以及cPLA2与线粒体膜磷脂结合的影响。6.通过质粒转染过表达cPLA2分析cPLA2对线粒体功能的影响。结果1.UDCA-LPE减轻肝I/R诱导的氧化应激I/R导致MDA含量显著提高,SOD活性和GSH水平下降。UDCA-LPE预处理可显著逆转肝脏I/R诱导的氧化应激水平升高。肝脏I/R降低了TRX2和TXNRD2的蛋白水平。UDCA-LPE可逆转I/R导致的这些氧化还原系统分子的变化。2.UDCA-LPE减轻肝I/R诱导的线粒体损伤I/R处理导致广泛的线粒体脊断裂,线粒体重电子致密基质凝聚,线粒体肿胀和线粒体膜破裂,而UDCA-LPE预处理后线粒体损伤明显减轻。除了线粒体形态的变化,I/R导致了线粒体生成得ATP减少,线粒体数量下降,膜电势下降。UDCA-LPE抑制了这一趋势。我们的结果表明I/R时BAX蛋白水平增加并且BCL2降低。UDCALPE抑制这些蛋白质的变化。并且I/R促使细胞色素C从线粒体释放到细胞浆中。UDCA-LPE预处理减少了细胞色素C的释放。3.UDCA-LPE抑制肝I/R诱导的线粒体分裂共聚焦图像显示,正常细胞具有管状且细长的线粒体,t-BHP导致细胞中的大多数线粒体呈破碎的点状形态。UDCA-LPE预处理可逆转t-HHP诱导的线粒体形态改变。I/R导致线粒体分裂相关蛋白dynamin-related protein 1（DRP1）和mitochondrial fission factor（MFF）的表达增加,而UDCA-LPE逆转了DRP1和MFF的增加。此外,I/R降低线粒体融合相关蛋白Optic atrophy protein 1（OPA1）,mitofusin 1（MFN1）和mitofusin 2（MFN2）的水平,UDCA-LPE增加了OPA1,MFN1和MFN2的含量。4.UDCA-LPE减轻肝I/R诱导的磷脂代谢紊乱与假手术组小鼠相比,I/R组小鼠肝脏的胆碱（phosphatidylcholine,PC）水平明显降低了2倍,磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）水平呈现出下降趋势,磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）水平降低,磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol,PG）水平明显降低。UDCA-LPE抑制了这些变化。磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）的水平在假手术组、I/R组和I/R+UDCA-LPE组小鼠中几乎相同,无统计学差异。总体来说,I/R导致磷脂水平低于正常。PC的分解代谢产物溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine,LPC）,PE的代谢产物溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine,LPE）在I/R过程中升高,UDCA-LPE抑制了其上升。I/R后游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFA）升高,而UDCA-LPE可以阻止其升高。I/R导致心磷脂（cardiolipin,CL）的水平下降,而UDCA-LPE则有所抑制了这种作用。5.UDCA-LPE抑制cPLA2介导的膜磷脂降解cPLA2的m RNA水平和蛋白质水平在I/R过程升高,而UDCA-LPE一定程度上逆转了这种效应。I/R小鼠表现出PLA2活性增加,UDCA-LPE预处理降低了肝脏PLA2活性的增加,使其接近正常水平。PC和PE的水平在I/R过程中有所下降。LPC/PC比值,LPE/PE比值在I/R处理后提高。而UDCA-LPE抑制了这一变化。共聚焦结果显示,cPLA2弥漫性分布在细胞浆。氧化应激处理后,cPLA2荧光信号强度显著增强,并且出现明显的点状增强。cPLA2和线粒体表现出明显的共定位。UDCALPE降低了cPLA2的荧光强度,并阻断了cPLA2与线粒体膜结合。6.cPLA2介导的膜磷脂降解导致了线粒体功能紊乱与对照组相比,cPLA2过表达显著增加了BAX表达,降低了BCL2表达。MDA,GSH,SOD和ROS水平结果表明,过表达cPLA2的Hep G2细胞比对照组的Hep G2细胞具有更强的氧化应激水平。结论1.肝I/R过程氧化应激水平明显升高2.肝I/R过程存在明显的线粒体损伤3.肝I/R过程存在cPLA2介导的磷脂代谢紊乱4.cPLA2介导的磷脂代谢紊乱导致了线粒体损伤5.UDCA-LPE可通过抑制cPLA2活性,进而减少线粒体损伤,降低肝I/R损伤程度。