论文部分内容阅读
多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform，GBM)是中枢神经系统(Central nervous system，CNS)常见肿瘤，异质性和侵袭性较高，病人五年存活率不超过10％。肿瘤组织周围正常脑组织中均可检测到GBM星形侵袭灶，不仅手术难以全切，术后辅助放化疗均被证实效果不佳。免疫治疗为癌症治疗带来了前所未有的改变和希望，然而目前尚未有针对GBM成功的免疫治疗方案。GBM肿瘤微环境高度复杂，其中免疫抑制型细胞聚集和细胞毒性T细胞匮乏是制约GBM免疫治疗的主要因素之一。
吲哚胺2，3-双加氧酶-1(Indoleamine2，3-dioxygenase-1，IDO1)是一种内源性免疫抑制介质，它通过在肿瘤微环境中促进调节性T细胞(regulatoryT cells，Tregs)的积累并消耗色氨酸进而抑制T细胞活性。根据对癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库分析得知，IDO1在GBM患者的脑肿瘤组织中信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid，mRNA)表达水平上调且IDO1mRNA表达较低的GBM患者具有总体生存优势。因此沉默IDO1代谢途径可能有益于GBM免疫治疗。近年来某些化学疗法，例如米托蒽醌(Mitoxantrone，MIT)会触发肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)并诱导树突状细胞(Dendritic cells，DCs)成熟进而在淋巴结中激活T细胞。基于此，本课题设想沉默IDO1表达的小干扰RNA(small interfering RNA，siIDO1)与MIT一起递送至肿瘤细胞内可减轻Tregs相关的免疫制动，同时增加肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigens，TAAs)的释放。2-甲基咪唑锌(Zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8)由于其表面带正电荷和极高表面比，是一种具有出色生物相容性的纳米级金属有机框架结构(Nano Metal-organic frameworks，NMOFs)，在siRNA压缩和化学药物分子装载效率方面具有独特功能。更为重要的是，内涵体/溶酶体的酸性环境可以触发ZIF-8的降解，从而促进药物从内涵体/溶酶体逃逸到细胞质中。巨噬细胞具有肿瘤迁移特性，使巨噬细胞成为GBM微环境中最丰富的细胞类型。究其原因为巨噬细胞表面的α4β1整合素蛋白轴和脑肿瘤细胞表达的血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1)主导了这种迁移。因此用带有α4β1整合素蛋白的胶质瘤相关巨噬细胞膜(Glioma-associated macrophage membrane，GAMM)表面掩盖制备仿生纳米粒可赋予纳米载体靶向GBM肿瘤细胞的性质。
根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)对GBM最新分类，GBM可分为异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)野生型GBM、IDH突变型GBM、not-otherwise-specified(NOS)型三种，且90％以上GBM的IDH突变位点为IDH1。GBM患者IDH1基因表达上调，且IDH1低表达GBM患者生存期更有优势。过表达的IDH1突变体可减少干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)诱导型趋化因子(包括CXC趋化因子配体10(C-X-Cmotifchemokineligand10，CXCL10))的分泌。CXCL10可募集表达趋化因子受体3(C-X-C motif receptor3，CXCR3)的活化T细胞，故而IDH1突变型GBM微环境中活化的T细胞浸润和积累量极低。将CXCL10局部递送至脑肿瘤微环境中可实现将活化的血源性免疫T细胞募集到中枢神经系统以纠正过表达IDH1突变的免疫学负调节作用。
本课题主要研究内容和结果如下:
1.THINR的制备及表征
本课题选用ZIF-8为载体封装MIT，随后采用静电吸附法制备共载MIT和siIDO1的纳米调节剂(Immune nano-regulator，INR)，从荷GL261脑肿瘤小鼠脑组织中分离肿瘤相关巨噬细胞膜，通过脂质体挤出仪制备肿瘤相关巨噬细胞膜包被的纳米调节剂(THINR)。借助粒径电位测定仪、透射电镜对纳米粒进行理化表征，显示THINR具有优良的核/壳结构，平均水合粒径为195.17±4.04nm，平均电位为-19.01±0.76mV，在pH=7.4缓冲溶液及细胞基础培养基(Dulbeccos modified eagle medium，DMEM)环境中7天内THINR粒径大小基本保持不变。利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)建立MIT含量测定方法学，荧光分光光度计建立FAM-siIDO1含量测定方法学。结果表明上述两种方法学专属性强，日内、日间精密度及回收率均符合要求，能够准确测定纳米载体中MIT及siIDO1的含量。体外释放结果表明当暴露于较低pH的环境(pH=5.0)时，MIT和FAM-siIDO1平均累计释放率分别为42.88％和58.42％，显示比pH7.4的PBS环境中更快的药物释放(19.66％和31.27％)。
2.THINR体外抗肿瘤及免疫效果评价
以GL261R132H细胞系为模型，通过细胞摄取实验证实THINR可通过α4β1-VCAM-1介导的主动靶向提高药物在肿瘤细胞的蓄积能力。用噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)实验考察纳米粒细胞毒性，表明THINR具有较高的毒性并呈现浓度依赖性。利用凋亡试剂盒检测各制剂组诱导肿瘤细胞凋亡能力，证明THINR具有最佳诱导肿瘤细胞凋亡能力。溶酶体逃逸实验证明THINR能够在酸性条件下降解，从而促进搭载的药物(MIT及siIDO1)释放进入细胞质及细胞核中。免疫学评价实验中，通过检测钙网蛋白(Calreticulin，CRT)外翻、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1，HMGB1)释放、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)含量三种指标来考察各制剂组诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡的能力，结果表明THINR组诱导肿瘤发生免疫原性死亡能力最强。将未成熟的DCs与经过制剂组处理的肿瘤细胞共孵育研究各制剂组促进DCs成熟的能力，结果证明相对于MIT，MIT+siIDO1和INR组的成熟DCs的百分比，THINR组中成熟DCs的百分比分别增加约2.12，1.68和1.19倍。用逆转录-聚合酶链反应(Realtime PCR，RT-PCR)实验验证不同制剂组沉默IDO1表达能力，结果表明用ZIF-8-siIDO1@GAMM处理后，GL261R132H细胞中IDO1mRNA表达水平显著下调(P＜0.001)。
3.THINR+CXCL10瘤内共递送介导的体内抗肿瘤药效学评价
采用IDH1突变型原位脑肿瘤为动物模型，造模12天后，瘤内给予不同治疗组。通过小动物活体实验、苏木精伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)染色、TUNEL染色等实验表明THINR与CXCL10联合治疗组相比较于其他组有明显的肿瘤抑制作用并显著延长的小鼠生存期(P＜0.05)。
基于上述理念，为了重塑“热”的肿瘤免疫微环境来攻击具有侵袭性肿瘤细胞并遏制IDH1突变型恶性神经胶质瘤发展，本课题构建一种搭载MIT和siIDO1的肿瘤归巢免疫纳米调节剂(Tumor-homing immune nano-regulator，THINR)和CXCL10瘤内共递送给药系统。其中THINR可跟踪并主动靶向脑肿瘤细胞，纳米载体随后在内涵体/溶酶体酸性刺激下分解，包载药物(MIT和siIDO1)从内涵体/溶酶体中逃逸并在肿瘤细胞中发挥免疫调节作用，激活T细胞并缓解了Tregs相关的免疫抑制。与此同时CXCL10将活化的T细胞募集到中枢神经系统中，以放大攻击肿瘤细胞免疫治疗效果，从而重塑“热”肿瘤免疫微环境以遏制IDH1突变型神经胶质瘤发生发展。
吲哚胺2，3-双加氧酶-1(Indoleamine2，3-dioxygenase-1，IDO1)是一种内源性免疫抑制介质，它通过在肿瘤微环境中促进调节性T细胞(regulatoryT cells，Tregs)的积累并消耗色氨酸进而抑制T细胞活性。根据对癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库分析得知，IDO1在GBM患者的脑肿瘤组织中信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid，mRNA)表达水平上调且IDO1mRNA表达较低的GBM患者具有总体生存优势。因此沉默IDO1代谢途径可能有益于GBM免疫治疗。近年来某些化学疗法，例如米托蒽醌(Mitoxantrone，MIT)会触发肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)并诱导树突状细胞(Dendritic cells，DCs)成熟进而在淋巴结中激活T细胞。基于此，本课题设想沉默IDO1表达的小干扰RNA(small interfering RNA，siIDO1)与MIT一起递送至肿瘤细胞内可减轻Tregs相关的免疫制动，同时增加肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigens，TAAs)的释放。2-甲基咪唑锌(Zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8)由于其表面带正电荷和极高表面比，是一种具有出色生物相容性的纳米级金属有机框架结构(Nano Metal-organic frameworks，NMOFs)，在siRNA压缩和化学药物分子装载效率方面具有独特功能。更为重要的是，内涵体/溶酶体的酸性环境可以触发ZIF-8的降解，从而促进药物从内涵体/溶酶体逃逸到细胞质中。巨噬细胞具有肿瘤迁移特性，使巨噬细胞成为GBM微环境中最丰富的细胞类型。究其原因为巨噬细胞表面的α4β1整合素蛋白轴和脑肿瘤细胞表达的血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1)主导了这种迁移。因此用带有α4β1整合素蛋白的胶质瘤相关巨噬细胞膜(Glioma-associated macrophage membrane，GAMM)表面掩盖制备仿生纳米粒可赋予纳米载体靶向GBM肿瘤细胞的性质。
根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)对GBM最新分类，GBM可分为异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)野生型GBM、IDH突变型GBM、not-otherwise-specified(NOS)型三种，且90％以上GBM的IDH突变位点为IDH1。GBM患者IDH1基因表达上调，且IDH1低表达GBM患者生存期更有优势。过表达的IDH1突变体可减少干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)诱导型趋化因子(包括CXC趋化因子配体10(C-X-Cmotifchemokineligand10，CXCL10))的分泌。CXCL10可募集表达趋化因子受体3(C-X-C motif receptor3，CXCR3)的活化T细胞，故而IDH1突变型GBM微环境中活化的T细胞浸润和积累量极低。将CXCL10局部递送至脑肿瘤微环境中可实现将活化的血源性免疫T细胞募集到中枢神经系统以纠正过表达IDH1突变的免疫学负调节作用。
本课题主要研究内容和结果如下:
1.THINR的制备及表征
本课题选用ZIF-8为载体封装MIT，随后采用静电吸附法制备共载MIT和siIDO1的纳米调节剂(Immune nano-regulator，INR)，从荷GL261脑肿瘤小鼠脑组织中分离肿瘤相关巨噬细胞膜，通过脂质体挤出仪制备肿瘤相关巨噬细胞膜包被的纳米调节剂(THINR)。借助粒径电位测定仪、透射电镜对纳米粒进行理化表征，显示THINR具有优良的核/壳结构，平均水合粒径为195.17±4.04nm，平均电位为-19.01±0.76mV，在pH=7.4缓冲溶液及细胞基础培养基(Dulbeccos modified eagle medium，DMEM)环境中7天内THINR粒径大小基本保持不变。利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)建立MIT含量测定方法学，荧光分光光度计建立FAM-siIDO1含量测定方法学。结果表明上述两种方法学专属性强，日内、日间精密度及回收率均符合要求，能够准确测定纳米载体中MIT及siIDO1的含量。体外释放结果表明当暴露于较低pH的环境(pH=5.0)时，MIT和FAM-siIDO1平均累计释放率分别为42.88％和58.42％，显示比pH7.4的PBS环境中更快的药物释放(19.66％和31.27％)。
2.THINR体外抗肿瘤及免疫效果评价
以GL261R132H细胞系为模型，通过细胞摄取实验证实THINR可通过α4β1-VCAM-1介导的主动靶向提高药物在肿瘤细胞的蓄积能力。用噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)实验考察纳米粒细胞毒性，表明THINR具有较高的毒性并呈现浓度依赖性。利用凋亡试剂盒检测各制剂组诱导肿瘤细胞凋亡能力，证明THINR具有最佳诱导肿瘤细胞凋亡能力。溶酶体逃逸实验证明THINR能够在酸性条件下降解，从而促进搭载的药物(MIT及siIDO1)释放进入细胞质及细胞核中。免疫学评价实验中，通过检测钙网蛋白(Calreticulin，CRT)外翻、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1，HMGB1)释放、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)含量三种指标来考察各制剂组诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡的能力，结果表明THINR组诱导肿瘤发生免疫原性死亡能力最强。将未成熟的DCs与经过制剂组处理的肿瘤细胞共孵育研究各制剂组促进DCs成熟的能力，结果证明相对于MIT，MIT+siIDO1和INR组的成熟DCs的百分比，THINR组中成熟DCs的百分比分别增加约2.12，1.68和1.19倍。用逆转录-聚合酶链反应(Realtime PCR，RT-PCR)实验验证不同制剂组沉默IDO1表达能力，结果表明用ZIF-8-siIDO1@GAMM处理后，GL261R132H细胞中IDO1mRNA表达水平显著下调(P＜0.001)。
3.THINR+CXCL10瘤内共递送介导的体内抗肿瘤药效学评价
采用IDH1突变型原位脑肿瘤为动物模型，造模12天后，瘤内给予不同治疗组。通过小动物活体实验、苏木精伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)染色、TUNEL染色等实验表明THINR与CXCL10联合治疗组相比较于其他组有明显的肿瘤抑制作用并显著延长的小鼠生存期(P＜0.05)。
基于上述理念，为了重塑“热”的肿瘤免疫微环境来攻击具有侵袭性肿瘤细胞并遏制IDH1突变型恶性神经胶质瘤发展，本课题构建一种搭载MIT和siIDO1的肿瘤归巢免疫纳米调节剂(Tumor-homing immune nano-regulator，THINR)和CXCL10瘤内共递送给药系统。其中THINR可跟踪并主动靶向脑肿瘤细胞，纳米载体随后在内涵体/溶酶体酸性刺激下分解，包载药物(MIT和siIDO1)从内涵体/溶酶体中逃逸并在肿瘤细胞中发挥免疫调节作用，激活T细胞并缓解了Tregs相关的免疫抑制。与此同时CXCL10将活化的T细胞募集到中枢神经系统中，以放大攻击肿瘤细胞免疫治疗效果，从而重塑“热”肿瘤免疫微环境以遏制IDH1突变型神经胶质瘤发生发展。