大气颗粒物(particulate mater,PM)日渐成为众所关注的环境问题和社会问题,因其对人体健康的危害极大而越来越受到世界各国政府和卫生机构的关注。其中危害尤其严重的为细颗粒物PM2.5,它能够引起呼吸系统、心血管系统等一系列引起健康危害的疾病,而且可能引起免疫、生殖和发育毒性,甚至有致畸、致突变和致癌的危险,因此其不仅严重影响当代人的健康,也影响下一代的健康。近年来,PM的毒性研究大多采用A549、Beas-2B等永生化的细胞系,而常用的遗传毒性评价模型一般采用CHL等细胞系。但是以上细胞系具有遗传物质改变、种属差异等缺点,因此建立基于人源正常细胞的毒性评价体系,是毒理学评价研究方法的发展趋势。故本研究中采用来源于人胚胎干细胞系H9的成纤维细胞EBf-H9(embryo body fibroblasts-H9),EBf-H9的体外培养和分化条件已经标准化,遗传特征与体内正常成纤维细胞接近,并且批次间差异小,可传代次数多,核型稳定,重复性强,较传统细胞系能更准确反映人体细胞对毒物的真实反应。目的本研究采用EBf-H9细胞作为毒性评价模型研究汉阳PM2.5所致的DNA损伤,旨在揭示汉阳PM2.5 DNA损伤的作用模式与可能机制,为PM2.5的风险评估提供一个新的可选细胞模型,并为后续进一步机制研究提供一定参考。方法采用透射电镜观察PM2.5的形态;将汉阳PM2.5配制成浓度为6.25g/ml、12.5 g/ml、25 g/ml、50 g/ml、100 g/ml、200 g/ml、400 g/ml的染毒液,应用CCK-8试剂盒及LDH试剂盒检测汉阳PM2.5染毒24h EBf-H9细胞的细胞存活率和LDH漏出率;采用HE染色的方法观察汉阳PM2.5染毒24h EBf-H9细胞的形态;采用DCFH-DA探针检测汉阳PM2.5染毒1h EBf-H9细胞的细胞内总ROS含量;采用SOD试剂盒、GPx试剂盒、MDA试剂盒检测汉阳PM2.5染毒6h EBf-H9细胞内总SOD、总GPx、总MDA含量;选取细胞存活率90%以上相对无毒性剂量,采用单细胞凝胶电泳试验及双核细胞微核试验评价汉阳PM2.5染毒24h EBf-H9细胞DNA和染色体损伤程度;采用RT-PCR检测汉阳PM2.5染毒6h DNA损伤相关基因p53;采用Western blot检测汉阳PM2.5染毒6h DNA损伤相关蛋白γH2AX和PARP。结果与讨论由PM2.5的表征可以看出,汉阳PM2.5中有较规则的圆球形状的燃煤飞灰,形状规则密实状的烟尘集合体,以及形状不规则的长形、条状等盐类矿物。验证了PM2.5有着复杂的来源及成分。EBf-H9细胞毒性试验结果显示,随着PM2.5剂量的增加,细胞存活率逐渐降低,存在剂量效应关系,与人肺成纤维细胞相比较,该细胞模型相对更加敏感,细胞毒性作用更加明显。而LDH漏出率呈先增加后降低的趋势,存在剂量效应关系,分析高剂量出现LDH漏出率下降的原因可能是细胞开始大量死亡,导致LDH释放程度降低。通过染毒后细胞形态学的观察,可以看出,随着染毒剂量的增加,细胞数量逐渐减少。低剂量中开始出现细胞空泡变性,高剂量中出现核碎裂、核固缩的现象。活性氧ROS是生物体一类含氧化合物的总称,它包括有氧离子、过氧化物和含氧自由基等。ROS在细胞信号传导,和保持机体平衡起很大作用。根据流式细胞仪检测ROS结果看出,随着染毒剂量的增加,染毒短时间细胞内总ROS呈上升趋势,存在剂量效应关系。超氧化物化酶(SOD)能清除机体内过多的氧自由基,保护细胞免受氧化损伤。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)将机体内产生的有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物,保护细胞膜的结构及功能。当机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基不能完全被清除时,引发脂质过氧化并形成丙二醛(MDA)之类的脂质过氧化物。由氧化损伤指标结果可以看出SOD、GPx随染毒剂量的升高而减少,MDA随染毒剂量升高而增加,均存在剂量效应关系,表明随着剂量的增加细胞在短时间内就产生大量ROS,当ROS不能被清除时,EBf-H9细胞的SOD与GPx开始激活,抵抗细胞内过多的氧自由基,最终形成产物MDA,从而诱导细胞凋亡甚至导致其死亡。单细胞凝胶电泳试验与双核细胞微核试验是在细胞的DNA和染色体水平上评价受试物遗传毒性的常用方法。结果显示随着PM2.5剂量的增加,彗星拖尾率与双核细胞微核率逐渐上升,且存在明显的剂量效应关系,提示汉阳PM2.5造成了EBf-H9细胞DNA和染色体的损伤,表明汉阳PM2.5可引起细胞DNA完整性、染色体完整性和染色体分离的改变,具有一定的遗传毒性。由本实验室以往的研究结果比较发现,同目前常用的遗传毒性的评价模型CHL细胞系相比较,EBf-H9细胞更为敏感。RT-PCR和Western blot的实验方法广泛用于检测目的基因和蛋白的含量。本研究中,RT-PCR的方法检测EBf-H9细胞DNA损伤关键基因p53,结果显示其表达呈先上升后下降的趋势;Western blot方法检测γH2AX蛋白呈先上升后下降的趋势,PARP蛋白89kd片段呈整体上升的趋势。说明EBf-H9细胞DNA损伤可能是通过p53激活γH2AX造成DNA双链断裂,并启动修复蛋白PARP,随剂量增加,细胞的修复能力减弱。但是细胞DNA损伤是一个复杂的通路体系,可能经过多条通路、多种基因蛋白的共同调控作用,要完全揭示其作用模式及通路,还需要进一步的深入研究。结论本研究表明EBf-H9可作为PM2.5风险评估新的候选细胞模型;汉阳PM2.5具有一定的遗传毒性;初步表明汉阳PM2.5可导致EBf-H9细胞的DNA损伤和染色体损伤。由结果揭示PM2.5可能通过诱导EBf-H9细胞产生大量ROS,继而引发细胞自身产生一系列氧化损伤作用,最终导致细胞产生DNA损伤和染色体损伤。在此过程中DNA损伤修复通路可能是通过p53激活γH2AX,并启动修复蛋白PARP,在ROS所致的氧化损伤过程中或许具有一定的拮抗作用。