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膀胱上皮细胞癌是世界上发病最高的肿瘤之一，其在发达国家泌尿系统恶性肿瘤中发生率仅次于前列腺癌，在我国则居于泌尿系统肿瘤的首位。大量研究显示，具有高复发和高异质性的膀胱上皮细胞癌，在遗传性和表观遗传性方面存在众多异常。这对膀胱癌的早期防治和预后带来众多困扰。新近发现的DNA聚合酶iota (DNApolymerase iota, Pol ι)是Y家族DNA聚合酶的成员，是细胞内维持基因组稳定性的跨损伤修复途径(translesion synthesis, TLS)中的一员。Pol ι蛋白缺乏3’核酸外切酶活性，极易导致碱基错配。但高错配倾向的Pol ι表达可能受到严格调控，故在细胞内一般不发挥作用。一旦Pol ι表达异常，将可能主动参与DNA复制过程，导致基因突变进而产生肿瘤。前期研究发现，乳腺癌细胞中Pol ι高表达，且导致碱基突变率升高。另外在脑胶质瘤、食管癌、胃癌和前列腺癌等肿瘤组织中，也发现了Pol ι表达异常。这提示Pol ι的高致突变性在膀胱上皮细胞癌发生发展中可能也起到重要作用。了解Pol ι的表达调控及其功能，将增强对膀胱癌发生发展机制的理解，为寻找膀胱癌早期有效的防治靶标提供新思路。然而，目前对Pol ι的表达调控机制了解甚少，而且Pol ι在肿瘤发生发展中的分子功能仍扑朔迷离。本课题对人POLI基因在膀胱癌细胞中表达调控机制进行了研究，并探讨了异常表达的Pol ι在膀胱上皮细胞癌中的致突变作用及临床意义。本研究工作主要有以下几个方面的内容：1.首次鉴定转录因子c-Jun调控人POLI基因核心启动子（1）人POLI基因启动子的生物信息学分析及鉴定通过生物信息学软件对人POLI基因5′侧翼区约3000bp的序列进行分析，获得潜在的启动子区域和转录因子结合位点。成功构建含不同长度POLI基因5′侧翼序列的荧光素酶报告基因质粒并检测其活性，证实了人POLI核心启动子区域为-275/+63。生物信息学预测显示该区域存在潜在的AP-1家族转录因子结合位点。（2）c-Jun蛋白上调人POLI基因启动子活性通过人POLI基因启动子质粒与c-Jun真核表达质粒共转染，证实c-Jun蛋白可增强POLI启动子活性；而成功构建的c-Jun结合位点突变质粒的启动子活性较野生型质粒下降显著。（3）体外、内实验鉴定c-Jun蛋白与POLI启动子的结合获取HEK293细胞核蛋白，凝胶电泳迁移率变动实验(electrophoresis mobility shiftand supershift assay, EMSA)和染色质免疫共沉淀实验(chromatin immunoprecipitationassay, ChIP)证实c-Jun蛋白可与人POLI启动子区域结合。2.证实JNK/c-Jun信号通路调控Pol ι蛋白表达（1）DNA损伤剂紫外线(Ultraviolet ray, UV)诱导HEK293细胞后，人POLI基因启动子活性增强；Western Blot检测Pol ι蛋白升高，并与c-Jun及其上游信号JNK的活化正相关。（2）在HEK293细胞中，JNK特异性抑制剂(SP600125)和siRNA干扰c-Jun均抑制Pol ι蛋白表达，并减少了UV诱导的Pol ι蛋白。这证实JNK/c-Jun信号通路调控基础情况和UV介导的Pol ι蛋白表达。（3）膀胱癌细胞株T24的Pol ι蛋白表达比RT4中高，并与c-Jun活性相关；另外SP600125可抑制膀胱癌细胞中Pol ι蛋白表达。这说明JNK/c-Jun信号通路调控Polι蛋白表达的机制为一普遍规律。3.核内蛋白ATR和XPC通过JNK/c-Jun通路调控UV介导的Pol ι表达（1）在HEK293细胞中，siRNA干扰DNA损伤应答蛋白ATR和XPC后，抑制了UV诱导的JNK/c-Jun活性并减少Pol ι蛋白表达。Western Blot和Real-time进一步检测发现，ATR和XPC干扰不影响JNK/c-Jun的上游激活信号MKK4和MKK7，但增加了其抑制信号MKP-1的表达。这说明ATR和XPC通过JNK/c-Jun通路上调UV介导的Pol ι蛋白表达，提示核内DNA损伤应答途径与JNK/c-Jun信号转导之间存在交互作用。（2）在膀胱癌细胞株T24中，Western Blot检测发现：siRNA干扰核内蛋白ATR和XPC抑制了UV诱导的JNK/c-Jun活性并伴随着Pol ι蛋白减少。这说明在UV诱导的膀胱癌细胞中，核内蛋白ATR和XPC也通过激活JNK/c-Jun上调Pol ι蛋白表达。4.膀胱上皮细胞癌临床样本中Pol ι、c-Jun异常表达与病理分级相关性分析收集石蜡包埋的膀胱上皮细胞癌全切术后的临床组织标本，免疫组织化学法检测Pol ι和磷酸化的c-Jun蛋白水平，发现膀胱上皮细胞癌中Pol ι高表达并与磷酸化c-Jun水平一致。统计学分析证实高表达的Pol ι和活化的c-Jun与膀胱癌组织病理分级相关。这提示c-Jun调控的Pol ι表达升高在膀胱上皮细胞癌发生发展中发挥重要作用。5.膀胱癌细胞中JNK/c-Jun调控Pol ι的致突变作用UV损伤pSupF质粒后转染入高表达Pol ι的膀胱癌细胞株T24中，获取细胞内质粒并电转入SY204菌后，计算菌落突变数量发现突变频率明显升高；当SP600125预处理T24降低Pol ι表达后，突变频率则显著下降。经测序比对绘制的突变频谱显示，这些突变位点与Pol ι蛋白的致突变特点一致。这充分说明JNK/c-Jun调控的Pol ι参与膀胱癌细胞的高突变并促肿瘤发生，对深入理解肿瘤高遗传不稳定性具有重要意义。综上所述，本研究分析了人POLI基因5′侧翼非翻译区约3000bp序列，确定了启动子区域位于-275/+63，首次证实c-Jun可增强POLI基因启动子活性及蛋白表达，并在体外、内实验中明确c-Jun蛋白可与POLI基因启动子结合。进一步研究发现，JNK/c-Jun调控基础条件及UV介导的Pol ι蛋白表达；DNA损伤应答核内蛋白ATR和XPC，通过抑制MKP-1而不是激活MKK4/MKK7，调控JNK/c-Jun进而增加DNA损伤诱导的Pol ι表达，提示核内DNA损伤应答途径与JNK/c-Jun信号通路之间存在交互作用。本研究首次证实膀胱上皮细胞癌中Pol ι的表达增高与磷酸化c-Jun一致，并与临床样本的病理分级正相关，明确了膀胱癌细胞中JNK/c-Jun调控的Pol ι表达增高在DNA损伤修复中发挥了致突变作用，说明JNK/c-Jun调控的Pol ι可能扮演着诱变基因的作用。本课题为阐明Pol ι的转录调控机制及其对膀胱上皮细胞癌发生发展的重要作用提供了线索，为寻找新的抗癌策略奠定了基础。