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背景和研究目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一类以血糖持续升高为特征的代谢性疾病,临床上依据其对胰岛素依赖与否可分为Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)和Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)。糖尿病晚期可出现多器官损伤如糖尿病足、眼疾、肾病及心肌病等。糖尿病的治疗根据其类型不同、是否伴有并发症等而不同。一般地,Ⅰ型糖尿病需要长期给予胰岛素医治,Ⅱ型糖尿病的防治是在调节饮食结构的基础上,通过对促进胰岛素分泌或增强胰岛素敏感性或延迟食物吸收等药物进行单用或联合应用,严重者也可给予胰岛素治疗。因此,研发可以有效防治糖尿病的新型药物具有重大意义。BefA(Beta cell expansion factor A)是一种由人体肠道细菌产生的蛋白,研究显示该蛋白具有促进胰岛β细胞增殖的作用,提示其可能具有潜在的治疗糖尿病的价值。在本研究中,我们首先构建了原核BefA表达载体,利用大肠杆菌BL21系统进行蛋白表达与提纯,进而获得较高纯度的BefA重组蛋白,并通过灌胃给药方式观察了该重组蛋白对小鼠Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病模型的治疗效果。结果表明,口服BefA蛋白可以浓度依赖性的方式降低糖尿病小鼠的血糖、抑制组织炎症、促进胰岛β细胞增殖及胰岛素的分泌。同时,该蛋白对小鼠肠道菌群发挥积极调节作用。实验方法1.BefA蛋白的表达与纯化:将人工合成的BefA序列插入原核表达载体pET-28C后,转入BL21菌株,经IPTG诱导蛋白表达,并以His-tag镍柱进行蛋白纯化。通过SDS-PAGE电泳、Western-blot检测BefA蛋白的纯度和条带位置,以BCA蛋白浓度试剂盒测定纯化后的蛋白浓度。2.小鼠Ⅰ型糖尿病和Ⅱ糖尿病模型的构建、给药及疗效评价:1)Ⅰ型糖尿病模型的制备:小鼠连续5天腹腔中注射STZ(50 mg/kg/d)造模,当血糖浓度升至11.1 mM及以上并稳定7天后,视为造模成功,对照组注射等体积的生理盐水。取8周龄C57BL/6雄鼠60只,分四组,每组15只:正常对照组(C组);T1DM模型组(M组);低浓度BefA治疗组(MB 10组):10 μg BefA/只/2天及高浓度BefA治疗组(MB 50组):50 μg BefA/只/2天。2)Ⅱ型糖尿病模型的制备:以HFD饲养6周并结合低剂量STZ(30 mg/kg)腹腔注射制备Ⅱ型糖尿病小鼠模型,当血糖浓度在11.1 mM及以上并稳定7天后,视为造模成功。取8周龄C57BL/6雄鼠75只,每组15只,实验分组为正常对照组(C组)、T2DM模型组(M组)、低浓度BefA治疗组(MB 5组):5 μg BefA/只/2天,中浓度BefA治疗组(MB 20组):20 μg BefA/只/2天及高浓度BefA治疗组(MB 40组):40 μg BefA/只/2天。3)给药及其疗效评价:以包被液(0.9%的生理盐水配制的0.01%的明胶)重悬BefA蛋白,隔天灌胃给药,给药14次。通过测定血糖、体重和葡萄糖耐受等评价BefA对糖尿病小鼠模型的治疗效果。4)机制分析:采用Western-blot检测组织炎症信号通路蛋白(TLR-4、NF-κB)和凋亡增殖通路蛋白(Bax、Bcl-2、PDX-1)的表达水平。应用q-PCR检测炎症因子(TNF-α、IL-1β)的转录情况。通过免疫组化、HE染色、免疫荧光评价胰岛组织损伤、胰岛β细胞增殖及胰岛素的分泌情况等。在Ⅰ型糖尿病模型中,通过高通量测序分析BefA蛋白对小鼠肠道微生物数量和种类的影响。在Ⅱ型糖尿病模型中,采用油红O染色技术等检测肝脏细胞形态和油滴大小等;为了评价BefA蛋白对T2DM小鼠脂质代谢的影响,对CEBP-α基因在肝脏中的表达和转录情况也进行检测。实验结果1.BefA蛋白的表达与纯化:结果显示pET-28C-BefA表达载体构建成功,SDS-PAGE电泳和Western-blot显示纯化的BefA蛋白纯度在85-90%之间。2.BefA对Ⅰ型糖尿病小鼠模型的治疗:(1)口服BefA蛋白可明显降低Ⅰ型糖尿病小鼠的血糖并缓解其体重降低病症,呈浓度依赖性;(2)BefA蛋白可降低胰腺TLR-4和NF-κB蛋白表达水平并降低IL-1β和TNF-α的mRNA水平,并呈浓度依赖性;(3)BefA蛋白可降低小鼠胰腺中Bax/Bcl-2蛋白表达的比值,提高PDX-1蛋白的表达及转录水平,呈浓度依赖性;BefA蛋白可恢复胰腺组织形态、促进胰岛β细胞的增殖及胰岛素的分泌;(4)肠道菌群高通量测序结果表明,高浓度BefA组(MB 50组)提高了小鼠肠道益生性乳酸菌在目(o)、科(f)、属(g)水平上的丰度,还可以使得患病小鼠的肠道菌群结构组成更趋向于正常对照组小鼠。3.BefA对Ⅱ型糖尿病小鼠模型的治疗:(1)口服BefA可降低Ⅱ型糖尿病小鼠的高血糖及体重升高现象,且呈浓度依赖性;(2)BeA可降低Ⅱ型糖尿病小鼠胰腺和肝脏TLR-4、NF-κB、IL-1β及TNF-α的蛋白表达水平,且呈浓度依赖性;(3)BefA下调模型小鼠胰腺的Bax/Bcl-2蛋白表达比值、提高PDX-1的表达、促进β细胞的增殖并提高胰岛素的分泌水平;(4)BefA下调模型小鼠肝脏CEBP-α的蛋白表达及mRNA水平以抑制脂肪堆积,且呈浓度依赖性;(5)低浓度BefA对模型小鼠无显著疗效。结 论口服BefA可有效地缓解Ⅰ和Ⅱ型糖尿病鼠的血糖升高,抑制Ⅰ或Ⅱ型糖尿病鼠的体重降低或体重升高,机制可能与其抑制胰腺组织的炎症反应和细胞凋亡、促进胰岛β细胞分化增殖及促进胰岛素分泌有关。此外,BefA对糖尿病小鼠肠道菌群紊乱的矫正作用有利于糖尿病的治疗,而其抑制肝脏甘油三酯合成及抑制脂质堆积也有利于Ⅱ型糖尿病的治疗。