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在哺乳动物卵巢内,卵泡一般会经历由小到大的生长发育阶段,并在激素等多种因素的共同作用下选择走向两种不同的命运,或是发生排卵,或是发生闭锁。在整个卵泡生长和发育过程中,有超过99%卵母细胞会由于卵泡闭锁而消失,而只有不到1%的卵泡能够排卵,绝大多数卵泡的命运是通过凋亡过程而退化。之前对于调控卵泡闭锁机制的研究大都以颗粒细胞凋亡为焦点,而从卵泡内微环境变化角度研究卵泡发育和闭锁的内在机制却鲜有报道。因此,本试验基于GC/TOF-MS代谢组学技术,研究猪卵泡发育和闭锁过程中卵泡液内源性代谢物的变化,结合颗粒细胞糖脂相关基因表达和卵泡液氧化指标的变化,筛选能预测或反映与卵泡发育和闭锁相关的标志物,为提高家畜繁殖率和人工辅助生殖效率提供新的思路和方向。实验一:猪卵泡发育和闭锁时卵泡液内源性代谢物的变化。本试验基于气相色谱飞行时间质谱联用技术(GC/TOF-MS)对猪不同大小健康和闭锁卵泡液进行了测定,得到代谢物图谱,而后基于多维和单维统计分析方法,筛选出内源性差异代谢物。结果表明,无论是在卵泡发育阶段还是在卵泡闭锁阶段,健康大卵泡液组(LH组)和中等健康卵泡液组(MH组)之间,以及中等闭锁卵泡液组(MA组)和中等健康卵泡液组(MH组)之间都表现出统计学意义上的分离。代谢物结果分析显示存在多种与卵泡发育和闭锁相关的内源性差异代谢物。与MH组相比,LH组中除了葡萄糖(Glucose)、α-酮戊二酸(Oxoglutaric acid)、脯氨酸(Proline)和葡萄糖 1-磷酸(Glucose 1-phosphate)浓度有所升高(P<0.05)外,其余的包括柠檬酸(Citric acid)在内的差异代谢物浓度都表现出不同程度的降低(P<0.05);与MH组相比,MA组中除了 3-磷酸甘油(Glycerol 3-phosphate)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、D-半乳糖(D-Galactose)、L-肉碱(L-Carnitine)等极少数代谢物浓度显著降低(P<0.05)外,其余的包括葡萄糖、多种氨基酸、胆固醇(Cholesterol)、硬脂酸(Stearicacid)等在内的绝大多数差异代谢物浓度都表现出不同程度的升高(P<0.05)。由此可知,卵泡发育阶段卵泡内的代谢活跃度明显高于卵泡闭锁阶段,卵泡液内绝大多数的代谢物质都用于提高卵母细胞发育潜能,卵泡液内饱和脂肪酸浓度的降低一定程度上会保护卵母细胞免受损伤;卵泡闭锁时卵泡细胞代谢水平显著降低,大多数代谢物质滞留于卵泡液内,较高浓度的饱和脂肪酸浓度加速了颗粒细胞和卵母细胞的凋亡进程。实验二:卵泡发育和闭锁时卵泡颗粒细胞糖脂代谢相关基因表达和卵泡液抗氧化水平的变化。本试验结合糖原分布变化、理化指标及分子生物学方法探讨卵泡发育和闭锁时卵泡颗粒细胞糖脂代谢相关基因表达和卵泡液抗氧化能力的变化。结果发现,相比健康卵泡,闭锁卵泡中的糖原分布有所不同。糖原主要分布在卵泡腔内,健康卵泡颗粒细胞层糖原分布较少,而闭锁卵泡中颗粒细胞的糖原分布较多。颗粒细胞糖脂代谢结果显示,与MH组相比,GLUT1在LH组颗粒细胞内的表达极显著增加(P<0.01),GLUT3、GLUT8的表达却极显著降低(P<0.01);只有GLUT8在闭锁卵泡颗粒细胞中的表达发生显著变化,呈极显著降低(P<0.01)。脂代谢相关基因(ACACA、CD36、SCD、FADS2、ELOVL2、ELOVL5、CPT1A、FABP5、PLIN2)在MH组、MA组、LH组卵泡颗粒细胞中均有表达,且呈现出不同的表达模式。总体而言,与MH组相比,LH组颗粒细胞内ACACA、CD36 mRNA的表达显著增加(P<0.05),SCD、ELOVL2 和 ELOVL5 mRNA 的表达极显著增加(P<0.01);MA组颗粒细胞内,除了 CD36、PLIN2、FABP5 mRNA基因极显著升高(P<0.01)外,ACACA、FADS2、CPT1A mRNA表达极显著降低(P<0.01)。卵泡液抗氧化能力结果显示,在卵泡发育阶段,相比MH组卵泡液,LH组中的脂质过氧化作用的产物丙二醛(MDA)的含量显著降低(P<0.05),总抗氧化能力(T-AOC)显著增强(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量极显著升高(P<0.01),而总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量显著降低(P<0.05);在卵泡闭锁过程中,相比MH组卵泡液,MA组中的MDA水平极显著增加(P<0.01),T-AOC极显著降低(P<0.01),而CAT和T-SOD酶的含量却极显著增加(P<0.01)。由此可知,卵泡发育过程中颗粒细胞内SCD基因表达显著上调,在一定程度上能够保护卵母细胞免受饱和脂肪酸的损伤;卵泡闭锁时颗粒细胞内CPT1A基因表达下调,CD36基因表达上调可能会增加细胞内脂肪酸浓度,致使颗粒细胞遭受脂毒性而凋亡。卵泡发育过程中卵泡液总抗氧化能力增强,使得卵母细胞免受自由基的损害;卵泡闭锁过程中总抗氧化能力降低会加速卵母细胞的凋亡和退化。