[研究背景]据2012年中国肿瘤登记年报报告，结直肠癌（Colorectal carcinoma，CRC）和胃癌（Gastric cancer，GC）是我国大陆地区癌症发生（23.0%）和死亡（22.2%）的主要类型，术后复发和转移为患者死亡的主要原因。除了基于术后解剖学的TNM分期之外，目前尚没有可用于临床上预后指示和化疗耐药的生物标志。建立有效的术后预后预测标志物、发掘化疗耐药相关分子对于确证哪些患者术后可能出现复发转移并且需及时开展术后放化疗治疗，哪些患者对于化疗会产生抵抗，需要选择个体化治疗（如分子靶向治疗）具有重要意义。基于表达谱数据建立的分子标志群为寻找更为稳定的胃癌和结直肠癌预后预测指标提供了新方法，但目前已发表分子标志群中相互重叠的基因少且在不同队列中相互验证后发现预后预测一致性较差，至今没有高通量研究结果转化应用于临床。整合现有CRC预后相关分子标志群并建立新的免疫组化分子标志群，并在临床大样本队列中验证其在预后及疗效预测中的价值，是转化应用目前该领域研究的必备步骤。我们前期利用表达谱芯片筛选，构建蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）发现了胃癌转移相关关键基因NR4A2，而NR4A2在消化道癌症预后及疗效预测方面的作用尚未见报道。[研究目的]通过整合现有芯片数据建立对CRC具有稳定预后预测效果的，且在不同队列中能够有效预测CRC预后的免疫组化分子标志群，阐明NR4A2在CRC和GC中的术后化疗抵抗作用和预测价值，为癌症个体化治疗奠定基础。[研究方法]本研究首先综合分析目前已经研究的CRC预后相关分子群，应用生物信息学方法甄别各分子群依托的原始数据库，排除重复数据库，建立了一个CRC转移复发相关In-house分子标志群，并通过筛选获得了24个已发表的CRC相关分子标志群和9个具有完善预后信息的CRC相关基因表达谱数据库。将9个数据库按照平台的不同整合为4个合并数据库。确定基因身份后，采用NTP（Nearest template prediction）法对以上25个CRC预后相关分子标志群的预测可靠性和一致性在4个不同合并数据库中分别进行验证，评估其CRC预后预测价值。分析选取在各合并数据库中相关性和预测能力均较好的分子标志群构建以PPI为基础的功能亚网络，选取网络关键节点分子和各有效分子标志群中高度重叠的基因作为建立CRC预后相关分子标志群的候选基因。收集2001年到2009年在第二军医大学长海医院普通外科实施CRC根治术患者，经随访选取符合纳入标准的患者，收集其石蜡包埋组织样本制备组织芯片，建立CRC术后患者队列，应用免疫组化方法评估每一个候选分子标志对于CRC预后预测的价值，采用ROC曲线结合Leave-one out cross-validation（LOOCV）方法筛选有预测价值分子的最佳组合建立新的分子标志群，根据每一个标志的Cox回归系数建立公式，计算新建立分子标志群的风险评分（训练队列）。随后选取343例在2000年到2006年在广州中山大学第六附属医院普通外科实施CRC根治术的患者中，对分子标志群的预后预测价值进行验证（验证队列）。将人类NR4A2基因全长克隆至表达载体内转染肿瘤细胞，观察转染前后细胞的生长、侵袭、迁移、动物致瘤性以及对5-氟尿嘧啶（5-FU）和奥沙利铂耐药性的影响。同时还用PGE2对肿瘤细胞进行诱导，观察诱导前后NR4A2的表达情况及其肿瘤细胞化疗耐药性的改变和对化疗引起细胞凋亡的影响。应用本课题建立245例I-III期GC患者和682例CRC I-III期患者的术后随访队列，通过免疫组化实验评价NR4A2的表达量对于患者术后生存和术后化疗有效性的影响。[研究结果]整合在不同合并数据库中相关性较好且预后预测能力较强的5个分子标志群基因构建功能亚网络，从中筛选得到3个网络核心分子(GRB2，SHP2和ITGB1)和在所选5个分子标志群中重叠4次的分子POSTN作为建立分子标志群的候选分子。GRB2、SHP2和ITGB1在肿瘤组织中的表达以及POSTN在成纤维细胞中的表达均与不良无病生存（Disease-free survival，DFS）显著相关，且通过LOOCV计算为构建分子标志群的最佳组合。将分子标志群的免疫组化评分作为连续变量进行分析，利用ROC曲线评价对于五年DFS的预后评估。与TNM分期相比，分子标志群的风险评分在训练队列（AUC,0.860vs0.669; P<0.0001）和验证队列（AUC,0.788vs0.589; P<0.0001）均具有更好的预后预测效果，且对于疾病特异性生存（Disease-specific survival，DSS）同样具有良好的预测效果。将患者按照分子标志群风险评分在训练队列的中位数分为高风险组和低风险组，利用Cox回归模型评估分子标志群高风险评分对于DFS的影响，与低风险组相比，高风险组在训练队列（HR,8.32;95%CI,4.54-15.25）和验证队列（HR,2.94;95%CI,1.82-4.73）均预示着患者预后不良。在评估本研究所建的分子标致群对术后化疗人群预后预测中发现，与低风险组相比，高风险组人群术后DFS（HR：7.15，95%CI：4.35-11.76），DSS（HR：5.86，95%CI：3.16-10.86）均更差。在NR4A2体外实验研究中，我们发现稳定高表达NR4A2的胃癌细胞在动物体内致瘤性增强；在肠型中等分化胃癌细胞AGS和弥散型低分化转移性胃癌细胞HGC-27中，NR4A2高表达显著提高对5-FU化疗抵抗作用，显著降低5-FU诱导细胞凋亡；PGE2瞬时诱导后，NR4A2可通过PKA途径被诱导高表达，并增强化疗抵抗和抗凋亡作用。NR4A2在I-III期的胃癌细胞核中高表达，NR4A2免疫组化评分高（≥3）预示胃癌预后不良（DSS，log-rank test, P=0.011），分层分析发现NR4A2对预后的指示效果仅存在于接受化疗的人群中（P=0.016），多因素Cox回归模型分析发现NR4A2高表达是胃癌不良预后（DSS，HR=1.51, P=0.044）的独立危险因素。稳定高表达NR4A2的结肠癌细胞干性标志CD44和EpCAM表达量增高。错配修复基因完整和缺失的结肠癌细胞株在转染NR4A2后对化疗药物5-FU和奥沙利铂的化疗抵抗力均显著增加，显著降低化疗诱导的凋亡。CRC内源性NR4A2可通过PKA途径被PGE2诱导表达，并增强化疗抵抗和抗凋亡作用。NR4A2在I-III期的CRC细胞核中高表达。NR4A2免疫组化评分高（≥4）预测CRC不良（DSS，HR，1.94; log-rank P=0.015）。分层分析发现NR4A2对于CRC的预后预测效果仅存在于接受化疗的结肠癌人群中（HR=1.86, log-rank P=0.020）。多因素Cox回归模型分析发现NR4A2的高表达是CRC不良预后（DSS, HR=1.94, P=0.017）的独立危险因素。[研究结论]本课题建立了CRC预后相关的免疫组化分子标志群，其预后预测效果显著优于传统TNM分期，且对术后化疗效果有预测价值。炎症介质促进NR4A2表达，后者增强GC细胞和CRC细胞的化疗抵抗性和抗凋亡作用，显著预测CRC和GC化疗抵抗性。本研究的发现将对开展个体化治疗改善CRC和GC术后生存状况具有重要现实意义。