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研究背景：呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)是引起婴幼儿呼吸道感染最主要的病原体。婴幼儿住院病例中约有40%-50%的毛细支气管炎和25%的肺炎是由RSV感染所致。非高危人群感染RSV可仅引起普通感冒,但亦有小部分(0.5-2%)发展为严重的毛细支气管炎和肺炎；婴儿期严重RSV感染与少年期哮喘发生密切相关。由于RSV致病机制尚未阐明,目前尚无有效药物、疫苗问世。治疗和预防RSV感染导致的疾病的难点在于RSV在与宿主斗争过程中进化出了多种免疫逃避机制,包括抑制T细胞增殖作用,抑制DC细胞活化和功能,RSV非结构蛋白NS1和NS2可以抑制IFN-α产生和发挥抗病毒作用。酪氨酸激酶的磷酸化作用与酪氨酸磷酸酶的去磷酸化作用是生物体内普遍存在的调控细胞信号转导过程的重要作用方式,它们共同调节细胞内蛋白质的酪氨酸磷酸化水平。Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2(Src homology phospho-tyrosyl phosphatase2, SHP2)是起去磷酸化作用的一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2是PTPs家族中的一员,它广泛的表达在人体各种组织和细胞中,由基因PTPN11编码,其N末端含有2个SH2结构域。SHP2可以通过SH2结构域结合磷酸酪氨酸,由于构象的改变使其自身结构中的酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP酶)激活,对细胞内其他信号分子发挥去磷酸化的作用,故SHP2对细胞内的信号分子具有重要的调控作用。干扰素(interferon, IFN)是由病毒或其他激活剂刺激宿主细胞所分泌的一类细胞因子,具有广谱的抗病毒作用。IFN通过与其相应的受体结合,激活Jak/Stat (janus kinase, Jak; signal transducer and activator of transcription, Stat)信号通路,该信号经过转导和细胞内信号的级联放大作用,最终引发各类抗病毒蛋白的转录表达,从而发挥其抗病毒作用。关于RSV与IFN之间的相关性研究,目前已知RSV可通过其非结构蛋白(non-structual protein, NS)干扰宿主细胞产生IFN,但是否与IFN的效应阶段有关,目前尚未明确。IFN诱导活化的信号传递过程受三类重要的蛋白家族调控,分别是蛋白酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatases, PTPs)、细胞因子信号抑制物家族(Suppressor of cytokine signaling, SOCSs)和活化的STAT转录活性抑制蛋白家族(protein inhibitor of activated STAT, PIAS).这三大蛋白家族主要作用为负反馈调节细胞内信号通路以防止信号通路的过度激活。在IFN相关调控中,SHP2被证明是一种具有双重功能的蛋白,既可直接负反馈调节信号通路起到负调控作用,亦可通过干扰信号通路中其它调节蛋白的调控作用起到间接正向调控作用。然而,SHP2在RSV感染中的作用以及相关机制还有待研究。研究目的：研究SHP2在RSV感染中的作用及其相关的机制,为RSV致病机制尤其是RSV免疫逃逸机制研究提供依据。研究方法：1.细胞实验：1.1以RSV感染人非小细胞肺癌细胞A549为模型,通过RT-qPCR以及Western blot分别检测Shp2基因及蛋白表达；以特异性化学抑制剂PHPS1(phenyl hydrazono pyrazolone sulfonate1)抑制细胞内SHP2的功能,通过RT-qPCR检测RSV病毒结构蛋白F蛋白表达和病毒空斑形成实验(Plaque assay)检测RSV成熟病毒颗粒数量来明确RSV的复制情况；通过RT-qPCR检测SHP2对RSV感染后IFN-α产生的影响；以外源性IFN-α事先激活细胞Jak/Stat信号通路,用PHPS1抑制SHP2功能,通过RT-qPCR检测RSV病毒结构蛋白F的表达以及检测IFN-α下游的效应分子2’,5’-OAS1的表达来明确SHP2对RSV复制的影响和IFN-a信号通路的影响；通过Western blot检测Jak/Stat信号通路中Jakl和Stat1磷酸化水平的变化。1.2以RSV感染SHP2敲除的腹腔来源巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞,研究SHP2对免疫细胞中病毒复制的直接影响,通过RT-qPCR检测RSV病毒结构蛋白F蛋白的表达。2.动物实验：以RSV经滴鼻感染野生型C57BL/6小鼠以及巨噬细胞特异性SHP2基因敲除小鼠,通过RT-qPCR检测RSV病毒结构蛋白F蛋白的表达和炎症因子IL-4等的表达,肺组织HE检测肺部的炎症情况。研究结果：1.RSV感染12小时后,人非小细胞肺癌细胞A549中SHP2的蛋白表达水平明显增高。2.以特异性SHP2抑制剂PHPS1预处理A549细胞,RSV感染后,病毒RSV-F的表达以及细胞表达IFN-α的未受影响。3.先后以IFN-α、PHPS1预处理A549细胞,RSV感染后,病毒RSV-F的表达以及成熟病毒颗粒的释放均增加；与之相对应细胞内Jak/Statl信号通路中关键信号分子Statl的磷酸化水平受到抑制、Jak/Statl信号通路诱导活化的抗病毒蛋白2’,5’-OAS1的表达明显下降。4.RSV感染从巨噬细胞特异性SHP2基因敲除小鼠体内分离的骨髓来源巨噬细胞BMM/以及腹腔巨噬细胞PM,与野生型小鼠来源的细胞相比,病毒RSV-F表达水平升高。5.RSV感染单核细胞特异性SHP2基因敲除小鼠,与野生型小鼠相比,病毒在肺组织内RSV-F蛋白表达无明显差异；小鼠肺炎的病理改变以及肺内炎症因子的表达均没有明显差异。结论：1.RSV感染的上皮细胞中,SHP2对IFN-α产生无影响,但对IFN-α效应起正向调控作用；SHP2可促进α-干扰素诱导的Jak/Statl信号通路从而抑制RSV的复制。2.在RSV感染的巨噬细胞中,SHP2直接抑制RSV的复制。仅在小鼠的单核细胞中敲除SHP2对RSV复制没有影响。提示SHP2在巨噬细胞中可能起到与上皮细胞不同的生物学效应,相关机理有待阐明。