研究背景与目的：　　结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是世界上三大最常见的恶性肿瘤之一，侵袭性强，发展迅速。特别是随着人们生活习惯的改变，其发病率逐年上升，并呈现年轻化的趋势，目前年轻人结直肠癌患者占整个CRC的2%-8%。CRC进展机制的研究可为其临床治疗提供新的思路。　　S100蛋白家族与肿瘤的发生和发展密切相关，部分S100蛋白既可直接影响肿瘤，也可通过肿瘤微环境间接影响肿瘤。例如：S100B和S100A7既可直接促进肿瘤进展，还可通过促进肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）的浸润，间接促进肿瘤的发展。我们的前期研究发现S100A6具有直接促进CRC发展的作用，其机制有待进一步阐明；同时，S100A6是否可通过TAMs的介导对CRC产生间接作用，尚未见报道。　　磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路调控肿瘤的生长和转移等多种生物学过程。我们的前期研究发现，S100A6可促进宫颈癌和骨肉瘤细胞PI3K/Akt信号通路的激活。此外，该信号通路还参与炎症过程，上调M-CSF的表达，而M-CSF可募集和诱使巨噬细胞极化成M2型。　　本课题是以人结直肠癌细胞 LoVo、 SW480和人单核细胞系THP-1作为研究对象，既探讨S100A6对CRC细胞的直接作用和机制，也探讨 S100A6对肿瘤微环境中 TAMs的作用及其通过 TAMs对CRC发展的间接作用和可能机制。希望为阐明S100A6在CRC发展中的作用及机制积累实验依据，也为其临床治疗提供新的思路。　　方法：　　1.重组蛋白GST-人S100A6（GST-hS100A6）的制备与鉴定：通过原核表达方式制备GST-hS100A6和GST，经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定后保存于-80℃备用。　　2.GST-hS100A6对人CRC细胞系LoVo和SW480的直接作用及其机制探讨　　2-1.GST-hS100A6（30μg/ml）处理LoVo和SW480后：　　1）分别采用MTT法和划痕愈合试验检测细胞的增殖和迁移；　　2）通过Western blot检测细胞中Akt和p-Akt的变化。　　2-2.PI3K/Akt信号通路抑制剂 LY294002和GST-hS100A6单独或联合处理LoVo和SW480细胞24 h后，应用划痕愈合试验检测细胞的迁移能力。　　3. GST-hS100A6经由TAMs对人CRC细胞系LoVo和SW480的间接作用及机制探讨　　3-1.诱导 THP-1细胞为巨噬细胞：50 ng/ml佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）处理THP-1细胞24 h后，细胞停止增殖，大部分细胞从悬浮状态转变为贴壁生长，部分细胞伸出伪足，分化为巨噬细胞，该细胞用于后续实验。　　3-2.制备条件培养基：1）CM-A6-CRC的制备：GST-hS100A6处理人 CRC细胞后收集其培养上清，离心保存，此即条件培养基CM-A6-CRC；2）CM-A6-CRC-Mφ的制备：CM-A6-CRC处理巨噬细胞后收集其培养上清，离心保存，此即CM-A6-CRC-Mφ。　　3-3.CM-A6-CRC-Mφ处理LoVo细胞，MTT法检测细胞增殖能力的变化。　　3-4.将THP-1细胞铺于Transwell小室上室，PMA处理24 h诱导为巨噬细胞，再用CM-A6-CRC处理48 h后，分别与划痕0 h的LoVo和SW480细胞共培养24 h，检测CRC细胞迁移能力的变化。　　3-5.S100A6经TAMs介导的间接促LoVo和SW480细胞迁移的机制探讨　　1） CM-A6-CRC对巨噬细胞极化的影响：CM-A6-CRC处理巨噬细胞48 h，采用qRT-PCR检测细胞中M2型标志物CD206和M2型相关分子IL-10、M1型标志物iNOS的表达水平。　　2） qRT-PCR检测 GST-hS100A6处理48 h后的 LoVo和SW480细胞中具有促巨噬细胞向 M2型极化作用的因子 M-CSF和CCL2的表达。　　3）探讨S100A6促进CRC细胞中M-CSF表达上调的机制:　　LY294002和GST- hS100A6单独或联合处理LoVo细胞48 h，通过qRT-PCR和Western blot检测CRC细胞中M-CSF的表达。　　结果：　　1.成功制备后续实验所需的重组蛋白GST-hS100A6和GST。　　2. S100A6对人CRC细胞系LoVo和SW480的直接作用及机制　　2-1.GST-hS100A6对LoVo和SW480细胞的增殖无明显影响（P＞0.05）。　　2-2.GST-hS100A6促进LoVo和SW480细胞的迁移（P<0.01）。　　2.3.PI3K/Akt信号通路参与介导S100A6的促人CRC细胞迁移的作用（P<0.01）。　　3. S100A6经M2-TAMs介导的对人CRC细胞的间接作用及机制　　3-1.未发现GST-hS100A6具有经TAMs介导的对LoVo细胞增殖的作用（P＞0.05）。　　3-2.GST-hS100A6具有经TAMs介导的对LoVo和SW480细胞迁移的间接促进作用（P＜0.05）。　　3-3.CM-A6-CRC上调巨噬细胞中M2型标志物CD206和M2型巨噬细胞相关因子IL-10的的表达（P＜0.05），而M1型标志物iNOS的表达无明显变化（P＞0.05）。　　3-4.GST-hS100A6的处理上调LoVo和SW480细胞中具有促巨噬细胞向M2极化的分子M-CSF和CCL2的表达（P＜0.05）。　　3.5.GST-hS100A6单独处理后的LoVo细胞中M-CSF的表达明显升高（P＜0.05），而GST-hS100A6与LY294002联合处理后，M-CSF的表达低于 GST-hS100A6单独处理组（P＜0.05）。提示 M-CSF的升高的机制涉及PI3K/Akt信号通路的激活。　　上述结果提示S100A6可经由TAMs介导而间接促进CRC细胞的迁移，其机制可能是：S100A6上调LoVo和SW480细胞中M-CSF和 CCL2的表达，后两者诱导了巨噬细胞向 M2型的极化。同时， PI3K/Akt信号通路参与介导S100A6上调CRC细胞M-CSF的表达。　　结论：　　1.S100A6促进人CRC细胞的迁移，其机制涉及PI3K/Akt信号通路的激活。　　2.CRC微环境中的S100A6可经由TAMs介导而间接促进CRC细胞的迁移，其机制可能涉及 S100A6上调 CRC细胞中 M-CSF和CCL2的表达以及巨噬细胞向M2型的极化。　　3.S100A6上调CRC细胞中M-CSF，其机制涉及PI3K/Akt信号通路的激活。